Name: 급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이이식의 세포내 인류 세포분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 배우세요 급성 골수성 백혈병 세포의 mTORC1, JAK/STAT5, MAPK 신호경로를 포스포플로우 사이토메트리로 분석하는 방법을. 이 기술은 차세대 스펙트럼 유세포측정기를 활용하여 다중 인산화 단백질을 고감도로 측정합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ferrara, F., Schiffer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukaemia+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukaemia in adults.</a> Lancet. 381 (9865), 484-495 (2013).</li>
<li>Döhner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults%3A+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li>
<li>Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femoral+bone+marrow+aspiration+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Femoral bone marrow aspiration in live mice.</a> J Vis Exp. (89), e51660(2014).</li>
<li>Haas, A., Weckbecker, G., Welzenbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Phospho-Flow+cytometry+reveals+novel+insights+into+TCR+proximal+signaling+events.+A+comparison+with+Western+blot%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intracellular Phospho-Flow cytometry reveals novel insights into TCR proximal signaling events. A comparison with Western blot.</a> Cytometry A. 73 (9), 799-807 (2008).</li>
<li>Perbellini, O., Cavallini, C., Chignola, R., Galasso, M., Scupoli, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-specific+flow+cytometry+reveals+signaling+heterogeneity+in+t-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Phospho-specific flow cytometry reveals signaling heterogeneity in t-cell acute lymphoblastic leukemia cell lines.</a> Cells. 11 (13), 2072(2022).</li>
<li>Kornblau, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+activation+of+multiple+signal+transduction+pathways+confers+poor+prognosis+in+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Simultaneous activation of multiple signal transduction pathways confers poor prognosis in acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 108 (7), 2358-2365 (2006).</li>
<li>Perl, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+targeted+therapy+in+the+management+of+patients+with+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">The role of targeted therapy in the management of patients with AML.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2017 (1), 54µ65(2017).</li>
<li>Márton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+phosphorylation+of+signaling+proteins+in+the+prognosis+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Oncol+Res%22%5BJournal%5D)">The roles of phosphorylation of signaling proteins in the prognosis of acute myeloid leukemia.</a> Pathol Oncol Res. 30, 1611747(2024).</li>
<li>Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLT3+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%3A+what+is+the+best+approach+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 220-226 (2013).</li>
<li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+involved+in+the+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways involved in the regulation of mRNA translation.</a> Mol Cell Biol. 38 (12), e00070-e00118 (2018).</li>
<li>Nepstad, I., Hatfield, K. J., Grønningsæter, I. S., Reikvam, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PI3K-Akt-mTOR+signaling+pathway+in+human+Acute+Myeloid+Leukemia+%28AML%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The PI3K-Akt-mTOR signaling pathway in human Acute Myeloid Leukemia (AML) Cells.</a> Int J Mol Sci. 21 (8), ijms21082907(2020).</li>
<li>Jia, X., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-eIF4E%3A+A+new+target+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Phospho-eIF4E: A new target for acute myeloid leukemia.</a> Curr Protein Pept Sci. 22 (4), 328-335 (2021).</li>
<li>Ghosh, J., Kapur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mTORC1-S6K1+signaling+pathway+in+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Role of mTORC1-S6K1 signaling pathway in regulation of hematopoietic stem cell and acute myeloid leukemia.</a> Exp Hematol. 50, 13-21 (2017).</li>
<li>Park, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+resistance+in+acute+myeloid+leukemia+cells+is+mediated+by+a+novel+ATM%2FmTOR+pathway+regulating+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Therapeutic resistance in acute myeloid leukemia cells is mediated by a novel ATM/mTOR pathway regulating oxidative phosphorylation.</a> Elife. 11, 79940(2022).</li>
<li>Oki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+mTORC1+pathway+activity+in+vivo+reveals+marked+shifts+that+support+time-specific+inhibitor+therapy+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic mTORC1 pathway activity in vivo reveals marked shifts that support time-specific inhibitor therapy in AML.</a> Nat Commun. 12 (1), 245(2021).</li>
<li>Lee, H. J., Daver, N., Kantarjian, H. M., Verstovsek, S., Ravandi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+JAK+pathway+dysregulation+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The role of JAK pathway dysregulation in the pathogenesis and treatment of acute myeloid leukemia.</a> Clin Cancer Res. 19 (2), 327-335 (2013).</li>
<li>Liu, A. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+STAT5+signaling+overcomes+resistance+to+IDH+Inhibitors+in+acute+myeloid+leukemia+through+suppression+of+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting STAT5 signaling overcomes resistance to IDH Inhibitors in acute myeloid leukemia through suppression of stemness.</a> Cancer Res. 82 (23), 4325-4339 (2022).</li>
<li>Sung, P. J., Sugita, M., Koblish, H., Perl, A. E., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+mediate+resistance+to+targeted+therapy+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines mediate resistance to targeted therapy in FLT3-ITD acute myeloid leukemia.</a> Blood Adv. 3 (7), 1061-1072 (2019).</li>
<li>Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+translation+and+its+implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein translation and its implications for cancer.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).</li>
<li>This Standard Operating Procedure (SOP) describes methods for anesthetizing mice. , McGill University. 
 <a target="_blank" href="https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf">https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf</a> (2024).</li>
<li>Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. 
 <a target="_blank" href="https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi">https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi</a> (2021).</li>
<li>Suni, M. A., Maino, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell signaling proteins.</a> Methods Mol Biol. 717, 155-169 (2011).</li>
<li>Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+phosphorylation+and+cellular+signaling+events+by+flow+cytometry%3A+techniques+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications.</a> Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).</li>
<li>Chen, W., Luu, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1633, 51-73 (2017).</li>
<li>Perez, O. D., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-proteomic+immune+analysis+by+flow+cytometry%3A+From+mechanism+to+translational+medicine+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: From mechanism to translational medicine at the single-cell level.</a> Immunol Rev. 210, 208-228 (2006).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1mL 주사기 25G x 5/8 TW&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>#309626</td><td>골수 흡인용 주사기</td></tr><tr><td>1.7 mL 미세 원심분리기 튜브</td><td>프로가바이오</td><td>#LMCT1.7B</td><td>골수 흡인으로 회수된 세포를 분취하기 위해</td></tr><tr><td>BD 호라이즌 브릴리언트 스테인 버퍼</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>#563794</td><td>염색 공정용</td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>피델리스 애니멀 헬스</td><td>에티카 XR</td><td>생쥐를 위한 진통</td></tr><tr><td>셀드롭 FL 무제한</td><td>프로가바이오</td><td>#CellDrop 플로리다-UNLTD</td><td>세포 수의 경우</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>위센트 주식회사</td><td>#311-425-CL</td><td>골수 흡인으로 회수된 세포용 배지</td></tr><tr><td>Eppendorf 원심분리기 5427 R</td><td>밀리포어 시그마</td><td>#EP5429000260</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 열 비활성화 프리미엄 CA</td><td>위센트 주식회사</td><td>#090-450</td><td>염색 공정용</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>밀리포어 시그마</td><td>#F1635</td><td>세포 투과화</td></tr><tr><td>인간CD45 [HI30] 항체&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>#563792</td><td>BUV395와 결합된 항체</td></tr><tr><td>ID7000 스펙트럼 셀 분석기</td><td>소니</td><td></td><td>스펙트럼 유세포 분석기</td></tr><tr><td>이소플루란 99.9% 액체</td><td>맥케슨</td><td>#803250</td><td>생쥐 마취</td></tr><tr><td>Isospire (isoflurane) 흡입 마취제</td><td>데크라</td><td></td><td>생쥐 마취</td></tr><tr><td>살아있는/죽은 AO/PI</td><td>프로가바이오</td><td>CD-AO/PI-1.5</td><td>세포 수의 경우</td></tr><tr><td>살아있는/죽은 좀비 NIR</td><td>바이오레전드+B6:C12</td><td>#423106</td><td>스펙트럼 유세포 분석용</td></tr><tr><td>메탄올 용액</td><td>밀리포어 시그마</td><td>#179957</td><td>세포 고정</td></tr><tr><td>P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4] 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#2846</td><td>Alexa Fluor 488과 결합된 항체</td></tr><tr><td>p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2] 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#13148</td><td>Alexa Fluor 647과 결합된 항체</td></tr><tr><td>p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8] 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#9468</td><td>Alexa Fluor 594와 결합된 항체</td></tr><tr><td>p-STAT5 (Tyr694) [D47E7] 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#14603</td><td>PE와 결합된 항체</td></tr><tr><td>토끼 IgG 컨트롤 [DA1E]</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#2975</td><td>Alexa Fluor 488과 결합된 항체</td></tr><tr><td>토끼 IgG 컨트롤 [DA1E]</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#2985</td><td>Alexa Fluor 647과 결합된 항체</td></tr><tr><td>토끼 IgG 컨트롤 [DA1E]</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#8760</td><td>Alexa Fluor 594와 결합된 항체</td></tr><tr><td>토끼 IgG 컨트롤 [DA1E]</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#5742S</td><td>PE와 결합된 항체</td></tr><tr><td>소독 물티슈</td><td>캐나다 연합</td><td>#UCDWPR-9022</td><td>골수 흡인을 위한 소독</td></tr></tbody></table>

급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이이식의 세포내 인류 세포분석

Intracellular Phosphoflow Cytometry of Acute Myeloid Leukemia Patient-Derived Xenotransplants

실험 설계는 예를 들어 1일 전처리 시작 및 15일 처리 후 시작과 같은 다양한 시점에서 선택한 관심 단백질의 인산화 상태를 모니터링하는 것을 목표로 합니다. 이 기준선은 치료 후 신호 경로 활성화에서 후속 변화의 진실성을 확인하기 위한 중요한 대조군 역할을 합니다. 치료 15일 후, 투여된 마우스와 비히클 처리된 대조군의 경로 조절을 평가하기 위해 두 번째 비교가 수행됩니다(그림 4). 이 2단계 접근법을 통해 치료로 인한 효과와 기준선 변동성을 구별할 수 있습니다.
본 연구에서는 AML PDX 마우스 모델을 활용하였다. 마우스는 다음과 같은 돌연변이를 특징으로 하는 환자 유래 AML 세포를 이식하였다: 변이 대립유전자 분획(VAF)이 48%인 DNMT3AMR882H , NPM1W288fs VAF 36%, FLT3ITD VAF 10% 및 IDH2R140Q VAF 44%. 이식 후, 치료를 시작하기 전에 종양이 자랄 수 있도록 3주가 허용되었습니다. FLT3 돌연변이 이식 PDX 마우스는 위약, 길테리티닙(매일 15mg/kg) 또는 베네토클락스(매일 50mg/kg), 5-아자시티딘(매일 2.5mg/kg) 및 세다리주딘(매일 3mg/kg)의 세 가지 요법 중 하나로 15일 동안 치료했습니다(그림 4A).
얻어진 결과와 관련하여, 베네토클락스 기반 요법을 사용한 치료가 STAT5 및 RPS6 인산화를 크게 향상시켰다는 점을 언급할 필요가 있으며, 이는 이러한 경로가 치료 내성에 기여한다는 것을 시사합니다(그림 4E). 이와는 대조적으로, FLT3를 표적으로 하는 약물인 길테리티닙은 돌연변이 FLT3 효과기의 인산화 상태를 감소시키지 않았다. 테스트한 AML 검체에서 FLT3-ITD 이외의 추가적인 2차 돌연변이(예: IDH2)의 존재가 이러한 경로의 활성화에 기여하거나 2주에 걸친 약물 치료로 신호 전달이 감소된 AML 세포의 선택적 제거가 가능할 수 있습니다. 분석된 모든 인단백질은 동일한 세포 집단에서 게이트화되었기 때문에 인단백질 활성화를 비교할 수 있습니다. 이 실험에서 인단백질 염색에서 가장 강력한 상관관계는 p-STAT5와 p-RPS6 사이인 것으로 보이며(보충 그림 1A), 둘 다 처리 후 이 실험군에서 상향 조절됩니다(그림 4E). p-STAT5와 p-ERK 사이에는 덜 관계가 있는 것으로 보입니다(보충 그림 1B). 중요한 것은 세포 크기(FSC-A를 사용하여 평가)가 전체 p-STAT5 양성에 큰 영향을 미치지 않는다는 점이며, 염색 양성이 단순히 세포 크기의 산물이 아니라는 점을 강조합니다(보충 그림 1C). 이 실험적 프레임워크를 통해 신호 경로 조절에 대한 이러한 치료의 효과를 종합적으로 평가할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig01.jpg"> 
그림 1: 표적 신호 경로의 시각화 및 분석 전략. (A) p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) 및 p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)와 관련된 신호 전달 경로의 개요. p-STAT5 경로에서 JAK는 자가인산화를 거쳐 촉매 활성을 증가시킨 다음 특이적 티로신 잔기를 인산화하여 STAT 단백질을 위한 도킹 부위를 생성합니다. 인산화된 STAT5(Tyr694)는 동형합체화되어 핵으로 전위되어 표적 유전자의 프로모터 영역에 있는 특정 STAT 반응 요소에 결합합니다. RAS-RAF-MEK-ERK 캐스케이드에서 리간드 결합 시 FLT3 수용체 또는 기타 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 자가인산화는 RAS에서 GDP를 GTP로 교환하여 RAS를 활성화합니다. 활성화된 RAS-GTP는 RAF를 원형질막으로 모집하여 RAF가 구조적 변화를 겪고 활성화됩니다. 그런 다음 RAF는 이중 특이성 키나아제인 MEK1/2를 인산화하고 활성화하며, 이는 다시 Thr202/Tyr204 잔기에서 ERK를 인산화합니다. 활성화된 ERK1/2는 핵으로 전위되어 특정 전사 인자를 인산화합니다. ERK1/2는 또한 중간 신호 전달 경로를 통해 mTORC1 활성을 증가시키고 특정 부위에서 eIF4E를 인산화하여 번역 활성을 증가시킬 수 있습니다. FLT3 및 기타 RTK를 통해 영양소 및 성장 인자에 의해 활성화되는 mTORC1은 S6K1 및 4E-BP1과 같은 다운스트림 표적을 인산화합니다. S6K1은 RPS6를 인산화하여 리보솜 기능을 향상시키고 번역을 활성화합니다. 4E-BP1의 과인산화는 eIF4E를 방출하여 번역 시작 복합체 eIF4F의 조립 및 캡 의존성 번역의 활성화를 가능하게 합니다. 이러한 모든 경로는 AML에 밀접하게 관련되어 세포 증식, 신진대사 및 세포자멸 신호에 대한 저항을 증가시켜 후천적 적응에 기여합니다. (B)는 골수 흡인 및 세포 내 인류 염색 결합 프로토콜의 주요 단계를 제시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig02.jpg"> 
그림 2: 골수 흡인 절차 중 중요한 단계의 시각화. 수술 부위와 필요한 재료는 층류 후드 아래에 설치됩니다. 이소플루란 흡입(A)에 의한 마취 후 대퇴 관절 표면은 흡인(B, C)을 위해 준비됩니다. 대퇴골은 대퇴골(D)의 중앙에 정렬된 첫 번째 주사기로 구멍을 뚫습니다. 바늘에 강한 압력을 가하지 말고 대신 회전 드릴링 동작을 수행하는 것이 중요합니다. 이것은 일반적으로 바늘이 뼈 표면을 뚫고 대퇴강의 경로를 따라가기에 충분합니다. 다음으로, 천자 부위(I,J)를 통해 두 번째 주사기로 골수를 흡인합니다. 골수 흡인을 미세 원심분리기 튜브(K)로 옮긴 후 해당 부위(L)의 출혈을 멈추기 위해 부드러운 압력을 가하고 마우스를 따뜻하고 깨끗한 케이지에 넣어 회복합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig03.jpg"> 
그림 3: isotype 컨트롤을 포함한 게이팅 전략 분석을 위한 워크플로우. (A)는 살아있는 세포, 이중선 배제 및 hCD45 양성 AML 세포에 대한 게이팅 전략을 나타냅니다. (B)는 갈색의 각 인단백질과 검은색의 동형 대조군에 대한 신호를 보여줍니다(두 개의 생물학적 복제). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig04.jpg"> 
그림 4: 생존 가능한 골수 AML 세포의 면역 진술 후 세포 내 인단백질의 검출 및 분석을 위한 워크플로우. (A) 환자 기증된 AML 세포를 생착한 NSG-SGM3 마우스는 비히클(대조군) 또는 베네토클락스, 5-아자시티딘 및 세다주리딘(vene/aza/CDZ) 또는 길테리티닙으로 처리되었습니다. 15일 후, 골수(BM) 흡인을 처리했습니다. (B)는 치료 15일 후 생존 가능한 AML 세포(예: hCD45/Zombie-NIR 양성)를 분석하기 위한 게이팅 전략을 나타냅니다. (C,D)는 베네토클락스/5-아자시티딘/세다주리딘 또는 비히클(B) 또는 길테리티닙 또는 비히클(C)로 처리된 마우스에서 분리된 10,000개의 AML 세포에서 표시된 바와 같이 각 인항체에 대한 신호의 정상화를 나타냅니다. 트레이스는 비히클(연한 파란색), vene/aza/CDZ(빨간색) 또는 길테리티닙(자주색)으로 처리된 대조 마우스에서 분리된 AML 세포의 신호를 나타냅니다. (E) 히스토그램은 3개의 마우스와 SD의 살아있는 인간 AML CD45+ 세포에서 테스트한 각 인단백질에 대한 염색 강도의 평균 값 변화를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 별표는 p 값이 0.05(*) 및 0.01(**) 미만인 ANOVA로 평가한 염색 강도의 유의미한 차이를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>항체</td>
			<td>형광 색소</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-RPS6 (Ser240/244)</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-4EBP1 (Thr37/46)</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-STAT5 (티르694)</td>
			<td>체육</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Erk1/2 (Thr202/Tyr204)</td>
			<td>AF647 시리즈</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>토끼 IgG 제어</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>토끼 IgG 제어</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>토끼 IgG 제어</td>
			<td>체육</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>토끼 IgG 제어</td>
			<td>AF647 시리즈</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 항체에 최적화된 희석액 목록.
보충 그림 1: 대표적인 AML PDX 샘플에서 p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 및 FSC-A를 비교합니다. 이 그림은 venetoclax/5-azacitidine/cedazuridine으로 치료한 지 15일째에 마우스 "E9"에서 p-STAT5, p-ERK 및 p-RPS6 간의 관계의 예를 보여줍니다( 그림 4C의 결과). 이 샘플에서 인단백질 염색에서 가장 강력한 상관관계는 p-STAT5와 p-RPS6(A) 사이에 있는 것으로 보이며, 둘 다 처리 후 이 실험군에서 상향 조절됩니다(그림 4E). p-STAT5와 p-ERK(B) 사이에는 관계가 적은 것으로 보입니다. 중요한 것은 세포 크기(FSC-A를 사용하여 평가)가 전체 p-STAT5 양성에 큰 영향을 미치지 않는다는 점이며, 염색 양성이 단순히 세포 크기(C)의 산물이 아니라는 점을 강조합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/Figure%20S1%20jove.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

To adapt and resist approved treatments, acute myeloid leukemia (AML) cells activate specific molecular pathways that lead to changes in gene expression, ...

우리의 연구는 급성 골수성 백혈병이 승인된 치료법에 대한 내성을 어떻게 발전시키는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 대사가 중요한 역할을 한다는 가설을 기반으로 합니다. 궁극적인 목표는 이러한 저항을 효과적으로 극복할 수 있는 전략을 식별하는 것입니다. 백혈병 연구에 널리 사용되는 유세포 분석법은 백혈병 세포와 같은 현유 세포를 분석하는 데 이상적입니다. 적응성은 데이터 분자 메커니즘을 위한 강력한 도구입니다. AML 연구의 주요 실험적 과제는 정확한 모델링을 위한 세포인 분자 소생에 대한 최적의 생체 내 프로토콜을 개발하고 치료제 내성의 기본 메커니즘을 이해하는 것입니다.[해설자] 시작하려면 마우스의 무릎을 구부리고 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 다리를 고정하여 천자 쪽이 위치한 대퇴골의 관절면을 노출시킵니다. 엄지손가락을 경골에, 검지손가락을 대퇴골에, 중지를 뼈 바깥쪽에 놓아 뼈를 안정시킵니다. 고정을 유지하면서 무릎 부위를 이소프로필 알코올로 소독하여 남아 있는 털을 옆으로 이동시키고 뼈 구조의 시각화를 향상시킵니다. 첫 번째 건식 25게이지 주사기를 사용하여 바늘을 대퇴골 관절 중앙에 놓고 부드럽게 돌려 힘을 가하지 않고 대퇴골 관절면에 구멍을 만듭니다. 바늘이 골수에 들어가면 주사기를 회전시키면서 서서히 빼냅니다. 두 번째 플러시된 주사기를 첫 번째 바늘로 만든 구멍에 삽입합니다. 대퇴골에 삽입된 두 번째 주사기에 진공을 적용하면서 부드럽게 회전하고 점차적으로 빼냅니다. 추출된 골수를 주사기 내용물을 500마이크로리터의 PBS가 들어 있는 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브로 세척하여 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 이소프로판올 면봉을 사용하여 천자 부위를 30초 동안 부드럽게 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 흡인 시스템을 사용하여 상청액을 부드럽게 흡인하고 버립니다. 형광 세포 염색 용액 샘플당 200마이크로리터를 추가합니다. 죽은 세포를 표지하기 위해 PBS에서 1에서 100으로 희석했습니다. 피펫으로 세포를 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 세포를 10분 동안 배양합니다. 10분 후, 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 흡인 및 버리고, 인간 조혈 세포를 표지하기 위해 2% 태아 소 혈청을 함유한 PBS에서 1에서 100으로 희석된 HCD 45 브릴리언트 자외선 395 항체 샘플당 100마이크로리터를 첨가합니다. 세포를 얼음 위에서 15분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 흡인하고 버립니다. PBS 용액에 1.6% 포름알데히드 1밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 10분 동안 배양합니다. 10분 후, 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 흡인하고 버립니다. 이제 섭씨 영하 20도에서 미리 냉각된 100% 메탄올 1밀리리터를 두 개에 직접 추가합니다. 샘플을 영하 20도에서 빛으로부터 보호한 30분 동안 배양합니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 흡인하고 버립니다. 각 샘플에 50마이크로리터의 항체 혼합 용액 또는 이소타입 대조군 혼합 용액을 첨가합니다. 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 다시 현탁시키고 모든 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 다음으로 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 세포를 피펫으로 부드럽게 재현탁하여 1000마이크로리터의 PBS로 세포를 세척합니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 다시 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 1000마이크로리터의 PBS를 사용하여 두 번째 세척을 수행하고 세포를 섭씨 4도에서 다시 원심분리하기 전에 피펫으로 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 상청액을 흡인한 후 최종 샘플을 200마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다. 이 그림은 15일 동안 베네토클락스 기반 요법으로 치료된 급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이식 마우스의 골수 세포에서 세포내 인단백질 신호의 워크플로, 게이팅 전략 및 정상화를 보여줍니다. 게이팅 전략은 전방 및 측면 산란 프로파일과 CD45 양성을 기반으로 생존 가능한 인간 급성 골수성 백혈병 또는 AML 세포를 성공적으로 식별하여 모든 치료 그룹에서 일관된 분석을 가능하게 했습니다. 베네토클락스 5-아자시티딘 및 CDZ 우리딘 치료는 AML 세포에서 STAT5 및 RPS6의 인산화를 증가시켜 내성과 관련된 생존 경로의 활성화를 시사합니다. 흥미롭게도, 마우스를 길테리티닙으로 치료했을 때, 치료는 FLT3 경로 단백질의 인산화를 유의하게 감소시키지 않았으며, 이는 표적 치료에도 불구하고 신호 전달이 지속되었음을 나타냅니다. 인산화된 STAT5 및 인산화된 RPS6은 베네토클락스 기반 요법 후 발현 수준의 상관관계에서 가장 강력한 상관관계 증가를 보였으며 이는 이러한 경로의 공동 활성화를 나타냅니다.

intracellular-phosphoflow-cytometry-acute-myeloid-leukemia-patient

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 백혈병 세포에서 단백질의 기질 사이토카인 유도 세포 내 인산화의 평가를 보여줍니다. 이러한 세포 내 인산화된 단백질은 phospho-flow cytometry 기술을 사용하여 정량화됩니다.

Phospho-Flow Cytometry를 사용한 Stromal Cytokine-Induced intracellular protein phosphorylation 평가

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Murine orthotopic PDAC homografts immunophenotyping에 실험 절차는 종양 면역 microenvironment 프로 파일링 목표로 합니다. 종양은 수술을 통해 이식 하는 orthotopically. 종양 크기에 200-600 m m3 의 수확 되었고 단일 셀 정지, 여러 면역 표식 FACS 분석 다른 붙일 표시 된 항 체를 사용 하 여 다음을 준비 하는 해리.

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

우리는 인간 1 차급성 골수성 백혈병 (AML) 견본에 있는 NKG2D 리간드 (NKG2DL) 검출을 위한 2개의 다른 염색 프로토콜을 제시합니다. 첫 번째 접근법은 융합 단백질을 기반으로 하며, 알려진 모든 잠재적으로 알려지지 않은 리간드를 인식할 수 있으며, 두 번째 프로토콜은 다중 항 NKG2DL 항체의 첨가에 의존한다.

급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법

여기에서 우리는 급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식 모델이 CD19 표적 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성을 평가하고 모니터링하기 위한 전략으로 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식식 마우스 모델을 이용한 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성 평가

우리는 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T-급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별했습니다. 염색은 분열하지 않는 세포에 유지되고 세포 증식 중에 감소하여 추가 조사를 위해 휴면 세포를 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 정지의 맥락에서 자가 재생을 연구하기 위한 기능적 도구를 제공합니다.

세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별 

이 프로토콜은 유세포 분석을 사용한 약물 반응 평가 지침과 함께 일시적 면역 억제 제브라피시 배아의 세포주 및 신선한 환자 물질에서 인간 급성 림프구 백혈병(ALL) 이종이식편을 생성하고 문제를 해결하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 실험 파이프라인은 고형 종양에도 적용할 수 있습니다.

제브라피시 배아에서 백혈병 세포 이식을 사용한 신속한 생체 내 약물 반응 예측

이 프로토콜은 주사 후 4일 후에 발생하는 환자 유래 B- 및 T- 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 난자 이종이식을 설명합니다.

오보에 위치 환자 유래 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 이종이식 (PDX-ALL)

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

배우세요 급성 골수성 백혈병 세포의 mTORC1, JAK/STAT5, MAPK 신호경로를 포스포플로우 사이토메트리로 분석하는 방법을. 이 기술은 차세대 스펙트럼 유세포측정기를 활용하여 다중 인산화 단백질을 고감도로 측정합니다.

급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이이식의 세포내 인류 세포분석

더 많은 동영상 탐색