급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이이식의 세포내 인류 세포분석

우리의 연구는 급성 골수성 백혈병이 승인된 치료법에 대한 내성을 어떻게 발전시키는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 대사가 중요한 역할을 한다는 가설을 기반으로 합니다. 궁극적인 목표는 이러한 저항을 효과적으로 극복할 수 있는 전략을 식별하는 것입니다. 백혈병 연구에 널리 사용되는 유세포 분석법은 백혈병 세포와 같은 현유 세포를 분석하는 데 이상적입니다. 적응성은 데이터 분자 메커니즘을 위한 강력한 도구입니다. AML 연구의 주요 실험적 과제는 정확한 모델링을 위한 세포인 분자 소생에 대한 최적의 생체 내 프로토콜을 개발하고 치료제 내성의 기본 메커니즘을 이해하는 것입니다.

[해설자] 시작하려면 마우스의 무릎을 구부리고 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 다리를 고정하여 천자 쪽이 위치한 대퇴골의 관절면을 노출시킵니다. 엄지손가락을 경골에, 검지손가락을 대퇴골에, 중지를 뼈 바깥쪽에 놓아 뼈를 안정시킵니다. 고정을 유지하면서 무릎 부위를 이소프로필 알코올로 소독하여 남아 있는 털을 옆으로 이동시키고 뼈 구조의 시각화를 향상시킵니다. 첫 번째 건식 25게이지 주사기를 사용하여 바늘을 대퇴골 관절 중앙에 놓고 부드럽게 돌려 힘을 가하지 않고 대퇴골 관절면에 구멍을 만듭니다. 바늘이 골수에 들어가면 주사기를 회전시키면서 서서히 빼냅니다. 두 번째 플러시된 주사기를 첫 번째 바늘로 만든 구멍에 삽입합니다. 대퇴골에 삽입된 두 번째 주사기에 진공을 적용하면서 부드럽게 회전하고 점차적으로 빼냅니다. 추출된 골수를 주사기 내용물을 500마이크로리터의 PBS가 들어 있는 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브로 세척하여 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 이소프로판올 면봉을 사용하여 천자 부위를 30초 동안 부드럽게 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 흡인 시스템을 사용하여 상청액을 부드럽게 흡인하고 버립니다. 형광 세포 염색 용액 샘플당 200마이크로리터를 추가합니다. 죽은 세포를 표지하기 위해 PBS에서 1에서 100으로 희석했습니다. 피펫으로 세포를 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 세포를 10분 동안 배양합니다. 10분 후, 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 흡인 및 버리고, 인간 조혈 세포를 표지하기 위해 2% 태아 소 혈청을 함유한 PBS에서 1에서 100으로 희석된 HCD 45 브릴리언트 자외선 395 항체 샘플당 100마이크로리터를 첨가합니다. 세포를 얼음 위에서 15분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 흡인하고 버립니다. PBS 용액에 1.6% 포름알데히드 1밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 10분 동안 배양합니다. 10분 후, 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 흡인하고 버립니다. 이제 섭씨 영하 20도에서 미리 냉각된 100% 메탄올 1밀리리터를 두 개에 직접 추가합니다. 샘플을 영하 20도에서 빛으로부터 보호한 30분 동안 배양합니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 흡인하고 버립니다. 각 샘플에 50마이크로리터의 항체 혼합 용액 또는 이소타입 대조군 혼합 용액을 첨가합니다. 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 다시 현탁시키고 모든 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 다음으로 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 세포를 피펫으로 부드럽게 재현탁하여 1000마이크로리터의 PBS로 세포를 세척합니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 다시 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 1000마이크로리터의 PBS를 사용하여 두 번째 세척을 수행하고 세포를 섭씨 4도에서 다시 원심분리하기 전에 피펫으로 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 상청액을 흡인한 후 최종 샘플을 200마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다. 이 그림은 15일 동안 베네토클락스 기반 요법으로 치료된 급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이식 마우스의 골수 세포에서 세포내 인단백질 신호의 워크플로, 게이팅 전략 및 정상화를 보여줍니다. 게이팅 전략은 전방 및 측면 산란 프로파일과 CD45 양성을 기반으로 생존 가능한 인간 급성 골수성 백혈병 또는 AML 세포를 성공적으로 식별하여 모든 치료 그룹에서 일관된 분석을 가능하게 했습니다. 베네토클락스 5-아자시티딘 및 CDZ 우리딘 치료는 AML 세포에서 STAT5 및 RPS6의 인산화를 증가시켜 내성과 관련된 생존 경로의 활성화를 시사합니다. 흥미롭게도, 마우스를 길테리티닙으로 치료했을 때, 치료는 FLT3 경로 단백질의 인산화를 유의하게 감소시키지 않았으며, 이는 표적 치료에도 불구하고 신호 전달이 지속되었음을 나타냅니다. 인산화된 STAT5 및 인산화된 RPS6은 베네토클락스 기반 요법 후 발현 수준의 상관관계에서 가장 강력한 상관관계 증가를 보였으며 이는 이러한 경로의 공동 활성화를 나타냅니다.