환자 유래 대장직장 종양 오가노이드(Patient-derived Colorectal Tumor Organoids)와 종양 침윤 림프구(TIL)의 공동 배양 시스템 구축

이 연구는 종양 침윤 림프구와 대장암 오가노이드의 상호 작용과 맞춤형 대장암 치료를 위한 TIL 기반 요법의 치료 잠재력을 탐구하는 것을 목표로 합니다. 우리의 프로토콜은 림프구에서 종양 침윤 림프구 예방을 단순화하고 환자의 열등한 효능 및 일반적인 이환율을 극복하는 대장암 오가노이드와의 공동 배양을 가능하게 합니다.

[해설자] 시작하려면 사용할 실험 시약과 실험실 착용을 준비합니다. 그런 다음 원발성 대장암 종양 조직을 5밀리리터의 PBS로 3회 헹구고 조직 세척 완충액으로 헹구십시오. 티슈 가위를 사용하여 티슈를 작은 조각으로 자릅니다. 다진 조직을 CRC 분해 완충액으로 옮깁니다. 조직이 완전히 해리될 때까지 섭씨 37도로 설정된 수조에서 샘플을 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 분해된 샘플에 동일한 부피의 Ad DMEM을 첨가하여 반응을 중화합니다. 현탁액을 섭씨 25도에서 5분 동안 380G에서 원심분리합니다. 이제 피펫을 사용하여 원심분리된 샘플에서 상청액을 버립니다. 1-3밀리리터의 예열된 적혈구 용해 완충액을 펠릿에 피펫팅하고 샘플을 섭씨 25도에서 10분 동안 배양합니다. 용해를 종료하기 위해 동일한 양의 Ad DMEM을 추가합니다. 튜브를 섭씨 약 25도에서 5분 동안 380G에서 원심분리합니다. 상청액을 폐기한 후 세포 펠릿을 적절한 부피의 Ad DMEM에 재현탁합니다. 현탁액에 트리판 블루를 첨가하여 생존 가능한 세포를 정량화하고 종양 조직의 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

종양 조직의 단일 세포 현탁액을 두 부분으로 나눕니다. 한 부분은 환자 유래 오가노이드 모델을 확립하기 위해 사용하고 다른 부분은 종양 침윤 림프구 배양에 사용합니다. 세포를 계수한 후 오가노이드 배양을 위해 웰당 80,000개의 세포를 마트리겔과 1:1 비율로 혼합합니다. 그런 다음 나머지 세포 현탁액을 24웰 플레이트의 완전 배지에 다시 현탁합니다. 종양 침윤 림프구를 원심분리기 튜브에 수집합니다. 웰 플레이트를 신선한 배지로 헹구어 남은 세포를 회수합니다. 동일한 원심분리기 튜브와 원심분리기로 옮깁니다. 상층액을 버린 후 2밀리리터의 PBS로 펠릿을 세척하고 다시 원심분리합니다. 다음으로, CD3 양성 마그네틱 비드를 사용하여 CD3 양성 T 세포를 분류하고 분리합니다. 분류 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 그런 다음 세포 현탁액을 컬럼으로 옮기고 마그네틱 비드 표지 세포가 컬럼에 남아 있도록 합니다. 분류가 완료되면 자석에서 분류 열을 제거합니다. 그런 다음 완충액을 첨가하여 유지된 양성 세포를 용리합니다. 용출된 세포를 2밀리리터의 PBS에 다시 현탁시키고 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다. 밀리리터당 100만 세포의 농도로 신선한 EMEM 배지와 함께 12웰 플레이트에 세포를 다시 현탁시킵니다. CD3 항체를 밀리리터당 5마이크로그램의 최종 농도로 첨가합니다. 항원 제시를 향상시키기 위해 오가노이드 배지에 인터페론 감마를 첨가합니다. 배양액을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 24시간 동안 배양합니다. 항 CD28 항체를 PBS로 밀리리터당 2마이크로그램의 농도로 희석합니다. 50마이크로리터의 항체 용액을 첨가하여 96웰 플레이트의 각 웰을 코팅합니다. 그런 다음 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉하고 배양합니다. 24시간 후, TrypLE를 사용하여 오가노이드를 단일 세포로 해리하고 계수합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 쌍을 이루는 종양 침윤 림프구를 수집합니다. 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포를 계산하고 PBS로 두 번 세척합니다. 웰당 10,000개의 세포로 각 웰에 오가노이드를 접종합니다. 종양 침윤 림프구를 웰당 100,000개 세포로 접종하여 이펙터 대 표적 비율을 10:1로 달성합니다. 보충된 RPMI 1640 배지에서 공동 배양을 수행합니다. 공동 배양을 3일 동안 배양하고 관찰 및 문서화를 위해 이미지를 캡처합니다. 공동 배양 기간이 끝나면 환자 유래 오가노이드와 종양 침윤 림프구를 원심분리기 튜브에 수집합니다. 수집된 세포를 PBS에서 300G에서 매번 5분 동안 두 번 원심분리합니다. 그런 다음 CD3 FITC, CD4 APC-Cyanine7, CD8 APC, CD107 APE-Cyanine7, CD279 PE 및 7-AAD를 포함하는 항체 칵테일을 준비합니다. 세척된 세포를 항체 칵테일 100마이크로리터에 다시 현탁시키고 20분 동안 배양합니다. 세포를 세척하기 위해 PBS 1밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 튜브를 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다. 마지막으로, 유세포 분석을 수행하기 전에 세포 펠릿을 500마이크로리터의 PBS에 다시 현탁합니다. 환자 유래 오가노이드는 12일 배양 기간 동안 눈에 띄는 확장을 보였으며 1일째에는 작은 클러스터가 관찰되었고, 6일에는 더 크고 더 많은 구조가 관찰되었으며, 12일에는 잘 정의된 성숙한 오가노이드가 관찰되었습니다. 오가노이드는 헤마톡실린 및 에오신 염색에서 알 수 있듯이 대장암 조직과 유사한 조직학적 구조를 나타냈습니다. 면역 염색은 조직과 오가노이드 모두에서 사이토케라틴-7 발현을 밝혀 사이토케라틴-20과 상피 동일성을 확인했으며 사이토케라틴-20도 두 샘플 유형 모두에서 강한 발현을 보였습니다. 증식 마커인 Ki-67과 장 분화 마커인 꼬리형 호메오박스 2에 대해서도 유사한 발현 패턴이 관찰되었다. 종양 침윤 림프구는 1일째의 희박한 분포에서 14일째에는 눈에 띄는 군집 및 22일째에는 조밀한 응집으로 점진적인 확장을 보였습니다. 면역형광 염색은 종양 침윤 림프구에서 세포의 면역 기원을 확인하는 강력한 CD45 및 CD3 신호를 보여주었습니다. 종양 침윤 림프구 집단에서 EpCAM 염색이 없어 확장된 세포에 상피 종양 세포가 없음이 확인되었습니다.