고처리량 스캐폴드 기반 배양 플랫폼으로서의 SPOT의 재현 가능한 제조

우리의 연구는 약물 스크리닝 분석 워크플로를 개선하고 고급 질병 모델링을 돕기 위해 강력하고 재현 가능한 환자 유래 기형학적 배양을 위한 고처리량, 스캐폴드 지원 플랫폼을 개발하는 데 중점을 두고 있습니다.

자동화된 액체 처리기, 스캐폴드 지원 하이드로겔 플랫폼, 장기 온 칩 기술, 유세포 분석 및 CYTOP과 같은 단일 세포 분석은 현재 사용 가능한 기술 중 일부입니다.

현재 과제에는 하이드로겔 무결성 보존, 실시간 이미징을 위한 겔 메니스커스 극복, 장기 오가노이드 기반 분석에서 균일한 세포 분포 보장 등이 포함됩니다.

당사의 프로토콜은 일관된 스캐폴드 지원 하이드로겔 로딩을 가능하게 하고, 메니스커스 문제를 최소화하고, 장기 오가노이드 배양을 지원하고, 자동화된 액체 처리기 및 고함량 이미징 시스템과 원활하게 통합됩니다.

우리는 질병 모델링 플랫폼을 사용하여 암의 질병 진행 메커니즘과 비만 발병을 탐구하는 것에 대해 가장 기대하고 있습니다.

[강사] 시작하려면 96 또는 384 SPOT에 대한 PMMA 패턴 스캐폴드를 사용합니다. 비계의 파란색 영역 주위에 여분의 종이를 다듬고 둘레에 5mm의 흰색 여백을 남깁니다. 결과 시트의 크기가 약 760mm x 1,300mm인지 확인합니다. 조립을 위해 96 SPOT 비계를 준비하려면 단단한 아크릴 지지대 위에 폴리에틸렌 필름 조각을 놓습니다. 이 필름으로 덮인 지지대를 작업 표면에 놓고 폴리에틸렌 필름 위에 비계를 놓습니다. 우물로 추적되지 않도록 비계의 처음 두 줄 사이에 눈금자의 가장자리를 정렬합니다. 비계 바닥에 추적 휠을 놓고 눈금자의 안내에 따라 위쪽으로 위쪽으로 굴립니다. 384 SPOT 비계의 경우 천공을 수행하지 마십시오. 다음으로, PDMS 슬래브에 거친 면이 위를 향하도록 비계를 놓고 행이 수평으로 이어지도록 합니다. 프라이밍 라인을 사용하여 어느 쪽이 거칠지 확인한 다음 스래브에 비계를 매끄럽게 하여 주름이나 기포를 제거합니다. 양면 테이프의 새겨지지 않은 면에서 보호층을 제거합니다. 테이프를 가운데에 살짝 버클링하고 테이프의 가운데 두 열을 비계에 맞춥니다. 이제 테이프 중앙을 비계에 눌러 정렬을 고정합니다. 테이프를 중앙에서 바깥쪽으로 매끄럽게 펴서 고르게 붙입니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 슬래브에서 비계를 부드럽게 들어 올립니다. 나중에 사용할 수 있도록 슬래브를 보관하십시오. 비계를 두 번째 웰 테이프에 부착하려면 비계를 뒤집어 테이프가 붙지 않은 매끄러운 면이 작업대에서 위를 향하도록 합니다. 두 번째 테이프의 새겨진 면에서 중간 보호층을 제거하여 두 개의 중앙 기둥을 노출시킵니다. 두 번째 테이프의 중앙을 살짝 버클링하고 비계의 중간 기둥에 정렬한 다음 테이프 중앙을 눌러 제자리에 고정합니다. 새겨진 테이프를 사용하는 경우 노출된 중앙에 인접한 나머지 보호층을 제거하십시오. 테이프를 중간에서 시작하여 바깥쪽으로 이동하면서 매끄럽게 만듭니다. 비계를 바닥 없는 판에 부착하려면 보호층을 제거하십시오. 바닥이 없는 판 아래의 비계를 뚜껑으로 정렬합니다. 정렬되면 가운데를 플레이트에 누릅니다. 새겨진 테이프를 사용하는 경우 인접한 층을 제거하고 비계를 중앙에서 바깥쪽으로 플레이트 위에 매끄럽게 만듭니다. 폴리카보네이트 필름에 비계를 부착하려면 핀셋을 사용하여 폴리카보네이트 필름의 한쪽에서 보호층을 조심스럽게 풀은 다음 필름에 움푹 들어가지 않고 보호층을 천천히 벗겨냅니다. 두 번째 면에 대해 이 과정을 반복한 다음 필름을 작업대에 따로 보관합니다. 플레이트 바닥에서 보호 테이프 층을 떼어내고 폴리카보네이트 필름을 중앙에서 바깥쪽으로 비계에 누릅니다. 그런 다음 폴리카보네이트 필름을 비계에 단단히 눌러 각 우물에 정의된 경계가 있는지 확인합니다. 정밀 칼을 사용하여 접시 바닥에서 여분의 재료를 조심스럽게 잘라냅니다. 완전히 조립한 후 96 SPOT 플레이트를 투명하고 재밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣고 생물 안전 캐비닛 밖으로 가져갑니다. 플레이트 아래에 단단한 아크릴 지지대를 놓고 clamp 반대쪽 모서리에 있습니다. 접시를 더 사용할 때까지 깨끗하고 건조한 공간에 보관하십시오. 384 SPOT 플레이트의 교대 웰을 30일의 테스트 기간 동안 플루오레세인과 PBS로 채웠을 때 배지 누출 또는 교환이 관찰되지 않았으며, 이는 웰 간 분리를 유지하는 데 있어 PMMA 장벽의 효능을 확인했습니다. 96개의 SPOT 플레이트에 파종된 GFP 발현 췌장 종양 오가노이드는 생존 가능성을 유지했으며 배양 0일부터 12일까지 점진적으로 확장되었습니다. 12일째에 SPOT으로 성장한 오가노이드는 내부 내강 구조의 존재와 함께 강력한 사이토케라틴 19 및 Zonula Occludens-1 발현을 나타냈습니다. 384개의 SPOT 플레이트에서 차선의 조직 파종 결과는 가장자리 정의와 세포 분포 균일성에 의해 시각적으로 구별할 수 있었습니다. 자동화된 액체 처리기를 사용하여 전체 96 SPOT 및 384 SPOT 플레이트에서 일관되게 균일한 파종이 달성되었습니다.