Name: 살아있는 세포에서 G 단백질 결합 수용체 활성을 측정하기 위한 BRET 기반 G 단백질 바이오센서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 배우세요 BRET 기반 G 단백질 바이오센서를 활용하여 살아있는 HEK293 세포에서 GPCR 리간드 자극에 따른 G 단백질 활성을 실시간으로 측정하는 방법을. 이 기술은 약리학 연구와 편향된 리간드 발굴에 활용됩니다.

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<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs.</a> Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+Advances+in+structures%2C+mechanisms%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).</li>
<li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">protein pathways.</a> Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+%CE%B22+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).</li>
<li>Hepler, J. R., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">G proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).</li>
<li>Van Unen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+FRET+sensors+for+robust+measurement+of+G%CE%B1i1%2C+G%CE%B1i2+and+G%CE%B1i3+activation+kinetics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells.</a> PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2411 (2001).</li>
<li>Galés, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+activation-promoted+structural+rearrangements+in+preassembled+receptor-G+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).</li>
<li>Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+constitutive+G+protein-coupled+receptor+activity+with+BRET-based+G+protein+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors.</a> Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).</li>
<li>Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+GPCR+functional+assays+based+on+resonance+energy+transfer+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).</li>
<li>Scott-Dennis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+membrane-based+Gi-CASE+biosensor+assay+for+profiling+compounds+at+cannabinoid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors.</a> Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).</li>
<li>Violin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+signaling+and+desensitization+elucidated+by+quantitative+modeling+of+real-time+cAMP+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics.</a> J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).</li>
<li>Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+isoproterenol+modulation+of+beta-adrenergic+receptor+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics.</a> Life Sci. 38, 309-315 (1985).</li>
<li>Thomas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+receptor+binding+analyses+of+cannabinoid+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists.</a> J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).</li>
<li>Schihada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+GPR35+have+distinct+extracellular+N-termini+that+allosterically+modify+receptor-transducer+coupling+and+mediate+intracellular+pathway+bias%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias.</a> J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6664">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68463">10.3791/68463</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68463">BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

<table><tbody><tr><td>고급 96웰 배양판, 흰색에 투명한 평면 바닥, 뚜껑 포함, Greiner bio-one</td><td>더처</td><td>655983</td><td></td></tr><tr><td>브라이트맥스 클리어라인 화이트 필름</td><td>더처</td><td>760245</td><td></td></tr><tr><td>클라리오스타 LVF</td><td>BMG 랩텍</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td><td>시그마</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 개조, 염화칼슘과 염화마그네슘 없이 액체, 멸균 여과, 세포에 적합</td><td>시그마&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>둘벡코 수정된 독수리' s 미디엄 (DMEM) 글루타맥스</td><td>시그마</td><td>D0822</td><td>37도 온도에서 따뜻함; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>태아 소 혈청(FBS)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>알파<서브>i3</서브>-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-금성</td><td>애드진</td><td>168122</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ 군나르 슐테의 선물</td></tr><tr><td>Galphas(짧은 아이소폼)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-금성</td><td>애드진</td><td>168124</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ 군나르 슐테의 선물</td></tr><tr><td>HEK-293T 안정적으로 CB1R 발현 (HEK CB1)</td><td></td><td></td><td>M. 구즈만(콤플루텐세 대학교, 마드리드, 스페인)의 친절한 기부입니다.</td></tr><tr><td>HEK-293T 야생형 (HEK 중량)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로테레놀</td><td>시그마</td><td>I6504</td><td>H20에 용해되어 &ndash에 저장됨; 20 & deg; C</td></tr><tr><td>리포펙타민 2000</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>옵티-MEM I 저감혈청 중량 글루타맥스 보충제</td><td>피셔</td><td>11564506</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 플래그 베타-2-아드레날린-수용체 태그 FLAG C-ter</td><td></td><td></td><td>D. 페레의 친절한 기부(IINS, 보르도)</td></tr><tr><td>pcDNA3.1-(empty)-TAG</td><td>애드진</td><td>138209</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 용액(PLL)</td><td>시그마</td><td>RNBL7086</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>승률 55,212-2</td><td>케이맨 케미컬스</td><td>10009023</td><td>DMSO에 용해되어 &ndash에 보관; 20 & deg; C</td></tr></tbody></table>

살아있는 세포에서 g 단백질 결합 수용체 활성을 측정하기 위한 bret 기반 g 단백질 바이오센서

BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

살아있는 세포에서 G 단백질 결합 수용체 활성을 측정하기 위한 BRET 기반 G 단백질 바이오센서

G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of transmembrane receptors, playing a crucial role in cellular signaling by transducing ...

bret-based-g-protein-biosensors-for-measuring-g-protein-coupled

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 우리는 chemotaxis를 조사에 대한 자세한 라이브 셀 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 마이 그 레이션 세포에서 이벤트를 신호의 spatiotemporal 역학을 모니터 형광 현미경 방법을 제시한다. 신호 이벤트의 측정은 더욱 GPCR - 신호 네트워크 chemoattractants 및 제어 진핵 세포의 방향 이주 감지 기울기를 달성 방법을 이해하기 위해 우리를 허용합니다.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다.

G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

G 단백질 결합 수용체에 의한 G 단백질의 선택적 활성화를 감지하는 간단한 방법은 세포 신호 전달에서 뛰어난 과제로 남아 있습니다. Fӧrster 공명 에너지 전달(FRET) 바이오센서는 GPCR을 G 단백질 펩타이드에 쌍으로 연결하여 살아있는 세포의 제어된 농도에서 구조적 변화를 조사하는 방식으로 개발되었습니다.

G 단백질 선택적 G​​PCR의 입체는 라이브 셀 서스펜션 형광 분석에서 FRET 센서를 사용하여 측정

Guanosine triphosphate (GTP) 결합은 G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) 활성화에서 가장 초기의 사건 중 하나이다. 이 프로토콜은 방사성 표지 된 GTP 유사체 [ 35 S] 구아노 신 -5'-O- (3- 티오) 트리 포스페이트 ([ 35 S] GTPγS)의 결합을 모니터링함으로써 특정 GPCR- 리간드 상호 작용을 약리학 적으로 특성화하는 방법을 설명합니다. 관심있는 리간드에 대한 반응.

무선 표지 된 GTP 결합을 통한 G- 단백질 결합 수용체 신호 측정

GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

GPCRs가 매력적인 약물 성 표적이라는 점을 감안할 때, GPCR 리간드 스크리닝은 따라서 납 화합물의 식별및 탈판화 연구에 필수적입니다. 이러한 노력에 대해, 우리는 PRESTO-탱고, TEV 기반 기자 분석기를 사용하여 약 300 GPCRs에서 과도 β arrestin2 모집의 동시 프로파일링에 사용되는 오픈 소스 자원 플랫폼을 설명합니다.

PRESTO-탱고 분석기를 사용하여 GPCR 전체 규모의 리간드 스크리닝을 위한 β-Arrestin2 모집의 병렬 심문

S1P는 S1P 수용체(S1PRs) 서브패밀리를 통해 다양한 생리적 효과를 발휘한다. 여기에서는 S1PR의 구조와 기능에 대해 설명하기 위해 파이프 라인에 대해 설명합니다.

스핑고신 1-인산염 수용체의 구조와 신호전달 경로를 조사하는 파이프라인

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

이 연구에서 제시된 프로토콜은 두 가지 방법을 통해 cAMP를 측정하는 데 있어 cAMP Difference Detector In Situ  의 효과를 보여줍니다. 한 가지 방법은 HEK-293 셀이 있는 96웰 플레이트 판독 분광 광도계를 사용하는 것입니다. 다른 방법은 형광 현미경으로 개별 HASM 세포를 보여줍니다.

In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학

배우세요 BRET 기반 G 단백질 바이오센서를 활용하여 살아있는 HEK293 세포에서 GPCR 리간드 자극에 따른 G 단백질 활성을 실시간으로 측정하는 방법을. 이 기술은 약리학 연구와 편향된 리간드 발굴에 활용됩니다.

살아있는 세포에서 G 단백질 결합 수용체 활성을 측정하기 위한 BRET 기반 G 단백질 바이오센서

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