Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

Jiani Ge; Yunfan Sun; Jingsheng Hua; Yuanhong Huang; Yi Wang; Dandan Tang; Taoyun Wang; Jinli Li; Yanfeng Deng; Song-Bai Liu

doi:10.3791/68469

유형 I 및 유형 II FLT3 억제제에 노출된 후 FLT3 돌연변이 발현 32D 세포에서 DNA 손상을 정량화하기 ...

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Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

유형 I 및 유형 II FLT3 억제제에 노출된 후 FLT3 돌연변이 발현 32D 세포에서 DNA 손상을 정량화하기 위한 혜성 분석

Full Text

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04:36 min

October 17, 2025

DOI: 10.3791/68469-v

Jiani Ge*^1,2, Yunfan Sun*³, Jingsheng Hua*⁴, Yuanhong Huang⁵, Yi Wang², Dandan Tang¹, Taoyun Wang¹, Jinli Li⁶, Yanfeng Deng⁷, Song-Bai Liu^1,2

¹Department of Chemistry and Life Sciences,Suzhou University of Science and Technology, ²Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology,Suzhou Vocational Health College, ³Department of Hematology,The Second Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine,Taizhou University, ⁵National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology,The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁶Department of Radiation Oncology,The Affiliated Hospital of Soochow University, ⁷Department of Medical Ultrasound,Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

이 프로토콜은 혜성 분석의 적용을 통해 FLT3 돌연변이 세포에서 유형 I 및 유형 II 억제제에 의해 유도된 DNA 손상의 차이를 정량화하는 효과적인 방법을 설명합니다.

Transcript

우리는 혜성 분석을 사용하여 32D FLT3 돌연변이 세포에 대한 유형 I 및 유형 II FLT3 억제제의 유전독성을 체계적으로 평가하여 AML의 임상 최적화를 위한 중요한 데이터를 제공합니다. 시술 중 미세수술 도구를 부적절하게 취급하면 슬라이드가 변경되어 샘플 손실이 발생합니다. 연구에 따르면 II형 억제제인 AC220은 FLT3 돌연변이 세포에 더 심각한 DNA 손상을 가하며, 치료 저항성을 극복하기 위해 DNA 손상 취약성을 이용하여 병용 요법 개발에 중요한 통찰력을 제공합니다.

AML 치료에서 FLT3 억제제의 작용 기전을 조사하고 FLT3 억제제를 기반으로 이중 약물 또는 다중 약물 병용 요법 전략을 개발합니다. 시작하려면 피펫을 사용하여 1.5밀리리터 튜브에 저융점 아가로스와 세포 현탁액의 10:1 혼합물을 준비하고 부드럽게 혼합합니다. 45도 각도로 고정된 피펫을 사용하여 아가로스 세포 혼합물의 55마이크로리터 분취량을 혜성 슬라이드에 분배합니다.

그런 다음 혼합물로 코팅된 슬라이드를 어두운 환경에서 섭씨 4도에서 30분 동안 놓습니다. 응고된 슬라이드를 예식된 용해 용액에 담그고 섭씨 4도에서 최소 1시간 동안 배양하여 슬라이드를 빛으로부터 보호합니다. 용해 후 용해 용액에서 슬라이드를 제거합니다.

피펫 건을 사용하여 패들 주변에서 가능한 한 많은 잔류 액체를 조심스럽게 빨아들입니다. 그런 다음 슬라이드를 알칼리성 전기영동 완충액에 넣고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 사전 평형을 유지합니다. 이제 슬라이드를 전기영동 챔버에 넣습니다.

슬라이드를 완전히 담그려면 예식된 알칼리성 전기영동 용액을 충분히 추가합니다. DNA 손상을 줄이기 위해 사전 평형화된 완충액을 사용하여 30분 동안 정전류로 24볼트에서 전기영동을 실행합니다. 전기영동 후 피펫 건을 사용하여 슬라이드 주변에서 알칼리성 전기영동 완충액을 흡인합니다.

슬라이드를 이중 증류수에 5분 동안 담근 다음 슬라이드를 70% 에탄올에 5분 동안 담급니다. 슬라이드를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 15분 동안 넣어 건조시킵니다. 다음으로, 100마이크로리터의 YeaRed 핵산 염색소를 슬라이드의 각 웰에 도포합니다.

빛이 보호되는 환경에서 슬라이드를 섭씨 28도에서 30분 동안 배양합니다. 슬라이드를 물로 부드럽게 헹구어 여분의 얼룩을 제거하고 섭씨 37도 인큐베이터에서 건조시킵니다. 혜성 분석은 FLT3 돌연변이 세포주에서 Gilteritinib 및 AC220에 의해 유도된 차등 DNA 손상 프로파일을 정량화하기 위해 체계적으로 사용되었습니다.

꼬리 DNA 백분율의 정량적 분석은 두 화합물 모두 2시간, 4시간, 6시간 후에 DNA 손상을 크게 증가시키며, AC220은 각 시점에서 길테리티닙보다 더 높은 손상 수준을 생성하는 것으로 확인되었습니다. 모든 모멘트 테일 측정은 2시간에서 6시간까지 두 처리 모두에 대해 통계적으로 유의미한 증가와 AC220 그룹 전체에서 관찰된 더 높은 OTM 값으로 꼬리 DNA 추세를 반영했습니다.