Name: 염기서열 특이적 핵산 분석을 위한 신호 리포터로 DNA 형광 라이트업 압타머를 활용하는 분할 혼성화 프로브 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 배우세요 분할 혼성화 프로브를 이용한 DNA 형광 라이트업 압타머 기반 핵산 분석 방법을. DAP-10-42 신호 리포터로 단일염기 치환을 정확히 검출하고 무표지 형광 신호 판독이 가능합니다.

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1. DAP-10-42를 신호 리포터로 사용하는 SLAS(Split Light-up Aptamer Sensor) 설계
<ol>
	<li>SLAS를 구성하는 두 개의 변형되지 않은 DNA 올리고뉴클레오티드 가닥의 염기서열을 설계합니다. DAP-10-42의 뉴클레오티드(nts) 4,6-39를 함유하는 단편을 사용한다(표 1, 도 1A).</li>
	<li>위치 nt 5에서 부풀어 오른 티민 잔류물을 제거하고, 줄기를 4 bp (nts 4,6-8 및 36-39)로 단축하고, 말단 C-G bp를 추가하여 줄기 1 (nts 1-8 및 36-42)의 서열을 줄기 1'로 변환합니다 (그림 1A, 1 단계). 또한 SLAS 가닥 중 하나에는 DAP-10-42 코어 서열의 nts 9-29가 포함되고 다른 SLAS 가닥에는 서열의 nts 30-35가 포함됩니다.</li>
	<li>nts 9-29를 포함하는 단편의 3' 말단 서열을 d(GGTCAT)로, nts 30-35 단편의 5' 말단 서열을 d(ATGACC)로 확장하여 6-bp 줄기 2를 형성합니다(그림 1A, 2단계). 참고: DAP-10-42에 있는 스템 1의 염기쌍 T4-A39, A6-T38, C7-G37 및 G8-C36은 앱타머의 점등 기능에 필요합니다. 스템 1'의 서열은 말단 bp에서만 수정할 수 있으며 G-C, A-T, T-A 염기쌍이 되거나 필요에 따라 1-2개의 염기쌍으로 확장될 수 있습니다. 스템 2의 순서는 임의적이며 변경될 수 있습니다. 그러나 분석 온도가 28°C 이상으로 상승하지 않는 한 스템 2의 열역학적 안정성이 유지되는 것이 좋습니다. 줄기 2를 단축하거나 불안정하게 만드는 것은 SLAS 기반 형광 분석의 높은 배경이 관찰되는 경우 표적 없이 조기 염료 결합을 방지합니다. nts 29-30 대신 nts 28-29, 27-28 또는 26-27 사이의 DAP-10-42 뉴클레오티드 서열의 분할도 허용됩니다(그림 1B).</li>
	<li>설계된 SLAS를 핵산 표적 또는 관심에 맞게 조정하려면 d(TT) 링커를 통해 표적-표적 결합 단편(arms)을 보완하는 DNA 염기서열로 stem 1'을 확장합니다(그림 1A, 3단계). 이를 통해 프로브를 구성하는 SLAS-U 및 SLAS-S의 가닥 염기서열을 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>SLAS-S의 타겟 결합 암을 SNS 사이트를 포함하는 표적의 7-10-nt 단편에 상보적이고, SLAS-U의 표적 결합 암을 SLAS-S의 표적 결합 군에 인접한 표적의 15-25 nt 단편에 상보적으로 만듭니다(표 1). 알림: SLAS-S의 타겟 바인딩 암을 DAP-4-39 시퀀스의 nt 10 또는 nt 42에 연결할지 여부는 선택 사항입니다(각각 그림 1, 암 1 또는 암 2).</li>
	<li>UNAFold 웹 서버(unafold.org)19를 사용하여 관심 대상과 SLAS-S 및 SLAS-U의 대상 결합 암 사이의 듀플렉스의 용융 온도(Tm)를 평가합니다.<ol>
		<li>웹 페이지 상단의 DINAMelt 탭을 클릭합니다. Applications(응용 프로그램)로 이동하여 Two State Melting Hybridization (보충 그림 3A)을 선택합니다. Two-State Melting Hybridization 페이지에서 왼쪽 상자에 상호 작용 서열 중 하나를 입력하고 오른쪽 상자에 다른 하나를 입력합니다(보충 그림 3B). 두 시퀀스가 모두 5'에서 3' 순서로 되어 있는지 확인합니다. 두 개 이상의 상호 작용 시퀀스 쌍을 세미콜론으로 구분하여 입력할 수 있습니다.</li>
		<li>페이지 하단에 분석 조건과 일치하도록 분석 온도(22°C), 1가 및 2가 양이온 농도(각각 20mM 및 25mM)를 표시합니다. 상호 작용하는 시퀀스의 농도를 나타냅니다.</li>
		<li>Submit(제출)을 누릅니다(보충 그림 3B). 결합의 Gibbs 에너지 변화, 엔탈피 변화 및 엔트로피 변화와 해당 듀플렉스에 대한 Tm 값을 포함하는 결과를 관찰합니다(보충 그림 3B).</li>
		<li>완전히 일치하는 타겟(M)과 SLAS-S 및 SLAS-U의 타겟 결합 암 사이의 듀플렉스에 대한 Tm 값이 분석 온도(현재 프로토콜에서 22°C)보다 높은지 확인합니다. 여기서,Tm 값은 각각 32.2°C 및 74.4°C였다(보충 그림 3C).</li>
		<li>SLAS-S와 SNS를 포함하는 일치하지 않는 타겟(MM) 사이의 듀플렉스가 분석 온도보다 Tm 낮은지 확인합니다. 이는 프로브 표적 인식의 높은 선택성을 보장하여 SLAS 결합 단편에 SNS가 포함된 경우 AO 플루오로겐이 표적 핵산 분석물의 존재 신호를 보내는 것을 방지합니다(그림 2). 여기서, Tm은 21.3°C(보충 그림 3C)였으며, 이는 정합된 복합체와 미스매치를 구별하기에 충분하였다.</li>
		<li>필요한 경우 표시된 안정성 요구 사항을 충족하기 위해 타겟 상보적 단편을 줄이거나 확장하여 타겟 결합 암의 서열을 조정합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>맞춤형 DNA 올리고뉴클레오티드를 공급하는 상용 공급업체로부터 설계된 가닥 SLAS-S 및 SLAS-U를 얻거나 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 사내에서 DNA 가닥을 합성합니다.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig1.jpg"> 
그림 1: 형광등 조명 앱타머(FLAP) DAP-10-42를 분할 조명 앱타머 센서(SLAS)로 변환. (가)DAP-10-4212의 2차 구조는 22°C, 20mM Na+, 25mM Mg2+에서 UNAFold Web Server19의 DNA 폴딩 애플리케이션에 의해 예측됩니다. 압타머는 스템 1에 의해 안정화된 G-quadruplex 모티브로 접히는 코어가 있는 헤어핀 2차 구조를 특징으로 합니다. DAP-10-42가 SLA로 변환되기 위해, (1) 압타머의 스템 1은 4 bp로 단축되고 측면에 추가 G-C bp가 있어 스템 1'을 만든다. (2) 코어 서열은 NT 29와 30으로 분할되며, 분할 부위의 3'- 및 5' 측면은 각각 상보적 서열 d(GGTCAT) 및 d(ATGACC)로 확장되어 스템 2를 만듭니다. (3) 줄기 1'은 관심 대상인 표적 결합 암의 인접한 단편에 상보적인 서열로 확장되며, 표적 결합 암과 프로브의 신호 보고 도메인 사이에 d(TT)-링커가 있습니다. (B) 코어는 또한 신호 및/또는 형광 폴드-증가의 현저한 손실 없이 nts 28-29, 27-28 또는 26-27 사이에서 분할될 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2.jpg"> 
그림 2: SLAS 신호 생성 메커니즘. SLAS는 SLAS-U 및 SLAS-S의 두 가닥과 형광 염료(예: Auramine O; AO)를 참조하십시오. 관심 있는 핵산 표적이 없는 경우, 두 가닥 모두 해리된 상태이며 염료를 결합할 수 없습니다. 신호가 관찰되지 않습니다(중앙). 완전히 일치하는 타겟 M이 있는 경우, SLAS-U와 SLAS-S는 모두 M 의 인접한 단편에 하이브리드화하여 코어 단편을 근접하게 만듭니다. 이것은 염료 결합 부위의 형성을 허용합니다. AO의 결합은 형광을 강화하며, 이는 형광 신호 판독으로 측정됩니다(왼쪽). SLAS-S와 상호 작용하는 단편에 단일 뉴클레오티드 치환(SNS)을 포함하는 일치하지 않는 타겟 MM 이 있는 경우 SLAS-U만 MM 타겟에 하이브리드화할 수 있으며 SLAS-S는 해리 상태에 있습니다. 이것은 염료 결합 부위의 형성을 방지하고 신호가 관찰되지 않습니다(오른쪽). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 표적 염기서열의 증폭
<ol>
	<li>SLAS assay로 분석할 유전자 단편을 증폭합니다. PCR 또는 RPA 증폭의 경우 비대칭 조건(예: Reverse Primer보다 10배 과도하게 Forward Primer가 추가된 경우)을 사용하여 단일 가닥 앰플리콘을 생성합니다. Linear After The Exponential (LATE) PCR20을 사용하여 NANOGP8 유전자로부터 126 nt 단편을 증폭하기 위해, 표 2에 나열된 프라이머 염기서열을 사용하십시오. 여기서, 126-nt 유전자 단편에 해당하는 단일가닥 DNA 주형(주형 NANOGP8 또는 주형 G1423C, 표 2)을 사용하였다. 이 템플릿은 Integrated DNA Technologies, Inc.에서 맞춤 합성했습니다.<ol>
		<li>10 μL의 10x Standard Taq 반응 완충액, 2 μL의 10 mM dNTP 혼합물(최종 농도 0.2 mM), 10 μL의 10 μM 순방향 프라이머 및 10 μL의 1 μM 역방향 프라이머(1 μM 및 0.1 μM의 최종 농도에 대해)를 혼합하여 100 μL PCR 반응을 준비합니다. 각각), 0.5 μL의 5U/μL Taq DNA 중합효소, DNA 템플릿 및 뉴클레아제가 없는 물. 템플릿이 없는 컨트롤의 경우 템플릿 대신 물을 추가합니다.</li>
		<li>다음과 같은 열순환 조건을 사용하십시오 : 95 ° C에서 1 분 동안 초기 변성; (1) 95°C에서 15초 동안 변성, (2) 60°C에서 30초 동안 프라이머 어닐링, (3) 68°C에서 30초 동안 프라이머 확장의 45 사이클; 68 ° C에서 5 분 동안 최종 확장. 참고: NASBA18 과 같은 전사 기반 증폭 기술은 특히 RNA 템플릿을 증폭에 사용할 수 있는 경우 PCR 또는 RPA 대신 사용할 수 있습니다. NASBA는 마이크로몰 범위의 최종 산물 농도에서 단일 가닥 RNA 앰플리콘을 생성하며, 이는 산물 농도 없이 다운스트림 SLAS 분석에 사용할 수 있을 만큼 충분히 높습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3M 아세트산 나트륨(pH 5.5)의 0.1배 부피와 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 증폭된 샘플을 에탄올로 침전시킵니다. -20 ° C에서 1 시간 동안 배양하고 12,000-18,000 x g 에서 5 분 동안 원심 분리기를 배양 한 다음 상등액을 버립니다.</li>
	<li>펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 다시 원심분리한 다음 상등액을 다시 버립니다. 펠릿을 자연 건조하고 10μL의 뉴클레아제가 없는 물에 용해시켜 SLAS 분석에 사용합니다.</li>
</ol>
3. SLAs를 이용한 형광 분석
<ol>
	<li>AO(DMSO에서 0.1mM, 10x), SLAS-S(뉴클레아제가 없는 물에서 10μM, 10x), SLAS-U(뉴클레아제가 없는 물에서 10μM, 10x) 및 4x 분석 버퍼(80mM Tris-HCl, pH 7.4, 100mM MgCl2, 80mM KCl)의 원액을 준비합니다. 참고: 칼륨 이온은 염료 결합 부위의 일부인 압타머의 추정되는 G-4중 모티프를 안정화하는 데 필요합니다. 1x 분석 버퍼에서 1mM KCl(25mM MgCl2에서)만으로도 블랭크(비표적 샘플; 보충 그림 2B). 마그네슘 이온은 핵산 가닥(SLAS-S, SLAS-U 및 표적 사이)의 상호 작용을 안정화합니다. 1x 분석 버퍼에서 Mg2+의 농도는 최소 5mM이어야 합니다(20mM KCl에서; 보충 그림 2C,D). AO(~1mM)의 원액을 DMSO에서 제조합니다. SLAS-S 및 SLAS-U의 스톡 농도는 임의적이며 가닥의 최종 농도가 유지되는 한 필요한 경우 조정할 수 있습니다(논의에서 최종 SLAS 농도 선택에 대한 근거 참조). 주의 : AO는 삼키면 유해하고 피부와 접촉하면 독성이 있으며 암을 유발할 것으로 의심됩니다. AO 솔루션으로 작업할 때는 항상 장갑을 착용하십시오. AO의 계량 및 원액 준비는 화학 후드 아래에서 수행되어야 합니다.</li>
	<li>표적을 제외한 모든 분석 성분을 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 샘플 부피(60 μL)에 샘플 수에 1을 더한 값(n+1)을 곱하여 마스터 믹스 부피(Vmix)를 계산합니다. 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq01.jpg" style="margin: auto;"> 표본 n의 수에는 필요한 음성 대조군과 양성 대조군이 포함되어야 합니다.</li>
	<li>0.25x V혼합 μL의 4x 분석 버퍼, 0.1x V혼합 μL의 0.1 mM AO, 0.1x V혼합 μL의 10 μM SLAS-S, 0.1x V혼합 μL의 10 μM SLAS-S를 결합합니다. 3.4단계에서 추가된 목표 부피를 수용하도록 의 최종 부피 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq02.jpg" style="margin: auto;"> 에 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. Vortex를 사용하여 마스터 믹스를 간단히 원심분리합니다. 마스터 믹스의 50 μL를 n개의 샘플 튜브에 부분 표본으로 추출합니다. 알림: 샘플 볼륨은 형광 신호를 감지하는 데 사용되는 기기의 특성에 따라 조정할 수 있습니다. 샘플 튜브에 분주되는 마스터 믹스의 부피는 3.4단계에서 추가된 목표 부피에 따라 조정할 수 있습니다. 마스터 믹스를 만들기 위해 첨가된 뉴클레아제가 없는 물의 양은 그에 따라 조정되어야 합니다. 예를 들어, 타겟 함유 샘플이 최종 샘플 부피의 10%(V/V)로 추가되는 경우, 물은 최대 0.9x V믹스까지 마스터 믹스에 첨가되어야 합니다.</li>
	<li>하나의 시료를 비표적 대조군(비어 있음)으로 사용하고 다른 시료를 양성 대조군으로 사용합니다. 타겟 함유 시료 10μL를 마스터 믹스(50μL)에 추가하여 10-1000nM 표적을 포함하는 60μL의 최종 시료 부피를 만듭니다. 블랭크의 경우 타겟 대신 뉴클레아제가 없는 물(10μL)을 사용합니다. 양성 대조군을 위해, 표적 염기서열을 포함하는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드(예: 표적 M, 표 1)를 사용합니다. 10 μL의 0.6-3 μM 대조군을 추가하여 0.1-0.5 μM 최종 농도를 만듭니다. 참고: 이 양성 대조군의 높은 형광은 테스트된 알려지지 않은 샘플에 대해 음성 신호가 관찰되더라도 분석이 예상대로 작동하도록 합니다.</li>
	<li>샘플을 혼합하고 마이크로 원심분리기를 사용하여 스핀다운합니다. 샘플을 22°C에서 10-60분 동안 배양합니다. 신호는 40분에서 60분 사이에 &lt;15%만 증가합니다(그림 3).</li>
	<li>형광 분광 광도계를 사용하여 475nm에서 여기 시 540nm에서 샘플의 형광을 측정합니다. 참고: 얇은 벽의 PCR 튜브에서 형광을 측정하는 휴대용 형광계를 사용할 수 있습니다. 형광측정기에는 AO 형광을 검출하는 데 적합한 여기 및 방출 필터가 있어야 합니다. 적합한 여기 필터의 예로는 495nm 단역 통과가 있습니다. 적합한 방출 필터의 예로는 510-580nm가 있습니다. 또는 UV 또는 Blue 광원이 있는 샘플에서 AO 형광이 여기될 때 신호를 시각적으로 관찰할 수 있습니다. 주의 : UV 램프를 사용하는 경우 자외선 차단 고글을 착용하십시오.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig3.jpg"> 
그림 3: SLAS-29U/30S에 대한 신호 생성의 시간 의존성. AO, SLAS-29U 및 SLAS-30S를 포함하는 샘플을 형광 분광 광도계의 동역학 모드(475nm에서 여기, 540nm에서 방출, 5nm 여기/방출 슬릿)를 사용하여 60분 동안 분석했습니다. 5분 시간(화살표로 표시)에 타겟 M 이 샘플에 추가되었습니다. 데이터는 2건의 독립적인 임상시험에서 얻은 평균을 구한 것이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol><li>Wetmur, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Probes%3A+Applications+of+the+principles+of+nucleic+acid+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).</li>
<li>Tyagi, S., Kramer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Beacons%3A+Probes+that+Fluoresce+upon+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization.</a> Nat Biotechnol. 14, 303-308 (1996).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+biosensor+molecular+beacon+probe%3A+challenges+and+recent+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">An elegant biosensor molecular beacon probe: challenges and recent solutions.</a> Scientifica. 2012, 928783(2012).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+binary+DNA+probe+for+highly+specific+nucleic+acid+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A binary DNA probe for highly specific nucleic acid recognition.</a> J Am Chem Soc. 128 (32), 10625-10628 (2006).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+probes+for+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Binary probes for nucleic acid analysis.</a> Chem Rev. 110 (8), 4709-4723 (2010).</li>
<li>Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+hybridization+enables+discrimination+of+a+point+mutation+within+5-40+C%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C.</a> J Am Chem Soc. 138 (41), 13465-13468 (2016).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+16S+rRNA+using+a+molecular+beacon-based+X+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor.</a> Biosens Bioelectron. 41, 386-390 (2013).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Hayson, A., Ballantyne, J., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecular+beacon+probe+is+sufficient+for+the+analysis+of+multiple+nucleic+acid+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">A single molecular beacon probe is sufficient for the analysis of multiple nucleic acid sequences.</a> Chembiochem. 11 (12), 1762-1768 (2010).</li>
<li>Gao, T., Luo, Y., Cao, Y., Pei, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+isolation+of+aptamers+to+light-up+the+dyes+and+the+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Progress in the isolation of aptamers to light-up the dyes and the applications.</a> Analyst. 145, 701-718 (2020).</li>
<li>Du, Y., Li, B., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFitting%26%2334%3B+makes+%26%2334%3Bsensing%26%2334%3B+simple%3A+Label-free+detection+strategies+based+on+nucleic+acid+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">&#34;Fitting&#34; makes &#34;sensing&#34; simple: Label-free detection strategies based on nucleic acid aptamers.</a> Acc Chem Res. 46 (2), 203-213 (2013).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M., Spelkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+%28split%29+light-up+aptameric+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Binary (split) light-up aptameric sensors.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 60 (10), 4988-4999 (2021).</li>
<li>Kato, T., Shimada, I., Kimura, R., Hyuga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+fluorophore--DNA+aptamer+pair+for+label-free+turn-on+aptamer+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Light-up fluorophore--DNA aptamer pair for label-free turn-on aptamer sensors.</a> Chem Commun. 52 (21), 4041-4044 (2016).</li>
<li>Connelly, R. P., Madalozzo, P. F., Mordeson, J. E., Pratt, A. D., Gerasimova, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+dye+binding+by+a+light-up+aptamer%3A+Application+for+label-free+multi-wavelength+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Promiscuous dye binding by a light-up aptamer: Application for label-free multi-wavelength biosensing.</a> Chem Commun. 57 (30), 3672-3675 (2021).</li>
<li>Kikuchi, N., Reed, A., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+dapoxyl+aptamer+for+sequence-selective+analysis+of+nucleic+acid+sequence+based+amplification+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Split dapoxyl aptamer for sequence-selective analysis of nucleic acid sequence based amplification amplicons.</a> Anal Chem. 91 (4), 2667-2671 (2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+detection+in+biologically+relevant+media+using+a+split+aptamer+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">MicroRNA detection in biologically relevant media using a split aptamer platform.</a> Bioorg Med Chem. 69, 116909(2022).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Nedorezova, D. D., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+light+up+aptamers+as+a+probing+tool+for+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Split light up aptamers as a probing tool for nucleic acids.</a> Methods. 197, 82-88 (2021).</li>
<li>Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+amplification+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications.</a> Clin Chem. 62, 947-958 (2016).</li>
<li>Compton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+sequence-based+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid sequence-based amplification.</a> Nature. 350, 91-92 (1991).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003).</li>
<li>Pierce, K. E., Sanchez, J. A., Rice, J. E., Wangh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear-after-the-exponential+%28LATE%29-PCR%3A+primer+design+criteria+for+high+yields+of+specific+single-stranded+DNA+and+improved+real-time+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Linear-after-the-exponential (LATE)-PCR: primer design criteria for high yields of specific single-stranded DNA and improved real-time detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8609-8614 (2005).</li>
<li>Grochans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+glioblastoma+multiforme-Literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of glioblastoma multiforme-Literature review.</a> Cancers. 14, 2412(2022).</li>
<li>Vaidya, M., Bacchus, M., Sugaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+sequences+of+exosomal+NANOG+DNA+as+a+potential+diagnostic+cancer+marker%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential sequences of exosomal NANOG DNA as a potential diagnostic cancer marker.</a> PLoS One. 13, e0197782(2018).</li>
<li>Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+stability+of+DNA+duplexes+in+solutions+containing+magnesium+and+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations.</a> Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).</li>
<li>Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+cations+in+G-quadruplex+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal cations in G-quadruplex folding and stability.</a> Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).</li>
<li>Chen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+of+free+and+protein-bound+auramine+O%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence of free and protein-bound auramine O.</a> Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).</li>
<li>Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+fluorogenic+dyes+as+environment-sensitive+probes%3A+Design+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications.</a> Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>아우라민 O</td><td>MP 바이오메디컬스&nbsp;</td><td>195064</td><td>신호 보고에 사용되는 형광 염료</td></tr><tr><td>Cary Eclipse 형광계</td><td>애질런트 테크놀로지스</td><td>G9800A</td><td>샘플의 형광 신호를 측정하기 위해</td></tr><tr><td>디메시 설폭사이드</td><td>MP 바이오메디컬스&nbsp;</td><td>196055</td><td>Auramine O의 원액을 제조하기 위한 용매</td></tr><tr><td>DNA 올리고뉴클레오티드(프라이머, SLAS 가닥, PCR용 합성 주형)</td><td>IDT</td><td>해당 사항 없음</td><td>공급업체가 맞춤 제작하고 탈염했으며 추가 정제 없이 사용</td></tr><tr><td>dNTP 혼합물, 10 mM</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>R0191</td><td>LATE PCR 반응용</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>인비트로젠</td><td>AM9530G</td><td>버퍼 구성 요소; 프로브의 가닥과 분석된 대상의 올바른 연관성을 위해 필요합니다.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브(1.5mL)</td><td>피셔브랜드</td><td>02-681-320</td><td>샘플 준비용 플라스틱</td></tr><tr><td>마이크로피펫(0.1-2.5 & micro; L)</td><td>에펜도르프</td><td>K56877G</td><td>샘플 준비에 사용</td></tr><tr><td>마이크로피펫(100-1000 & micro; L)</td><td>에펜도르프</td><td>K13160F</td><td>샘플 준비에 사용</td></tr><tr><td>마이크로피펫(20-200 & micro; L)</td><td>에펜도르프</td><td>J05253M</td><td>샘플 준비에 사용</td></tr><tr><td>마이크로피펫(2-20 & micro; L)</td><td>에펜도르프</td><td>G24675G</td><td>샘플 준비에 사용</td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td>코닝&nbsp;</td><td>6770</td><td>샘플&NBSP를 회전시키는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>뉴클레아제 프리 워터(DEPC 처리되지 않음)</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>AM9932</td><td>PCR 및 SLAS 분석의 샘플에 사용</td></tr><tr><td>PCR 튜브(0.5mL)</td><td>인비트로젠</td><td>AM9932</td><td>Quantus 형광계를 사용하여 형광을 측정하려면</td></tr><tr><td>피펫 팁(20-200 & micro; L)</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td>샘플 준비용 플라스틱</td></tr><tr><td>피펫 팁(1-10 uL)</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td>샘플 준비용 플라스틱</td></tr><tr><td>염화칼륨&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>AM9640G</td><td>버퍼 구성 요소; 프로브의 형광 조명 압타머 도메인을 올바르게 접는 데 필요합니다.</td></tr><tr><td>Quantus 형광계</td><td>프로메가</td><td>E6150</td><td>형광 측정에 사용할 수 있는 휴대용 저가형 형광계</td></tr><tr><td>석영 큐벳</td><td>스타나</td><td>16.50F-Q-10/Z15</td><td>Cary Eclipse 형광계를 사용한 형광 측정에 사용</td></tr><tr><td>표준 Taq 완충액이 포함된 Taq DNA 중합효소</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0273S</td><td>SLAS 분석으로 분석할 유전자 단편의 증폭을 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-HCl 완충액(pH 7.4)</td><td>보스턴 바이오프로덕츠</td><td>R-314 시리즈</td><td>버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>UVP</td><td>95-0016-14</td><td>시각적 신호 관찰을 위해 AO를 여기시키기 위해</td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>샘플 혼합에 사용</td></tr></tbody></table>

염기서열 특이적 핵산 분석을 위한 신호 리포터로 dna 형광 라이트업 압타머를 활용하는 분할 혼성화 프로브

Split Hybridization Probe Utilizing a DNA Fluorescent Light-up Aptamer as a Signal Reporter for Sequence-Specific Nucleic Acid Analysis

DAP-10-42 코어를 신호 리포터로 활용하는 SLAS의 성능은 공격적인 뇌종양인 교모세포종(GBM)의 진행에 중요한 NANOGP8 유전자 단편을 조사하도록 설계된 프로브를 사용하여 입증되었습니다21. 이 단편은 암세포에서 유래한 엑소좀의 DNA 화물에 SNS를 함유하고 있는 것으로 보고되었습니다22. 따라서 SLAS는 유전자의 SNS 부위에 맞게 조정되었습니다. nt 1423(GenBank NM_001355281.2)에서 각각 G 또는 C를 포함하는 NANOGP8 유전자의 염기서열을 모방한 합성 DNA 표적 M 또는 MM을 사용하여 이 프로토콜에서 SLAS 성능을 입증했습니다. 표적 M은 SLAS-S 가닥과 완전히 상보적인 반면, 표적 MM은 SLAS-S와 G&gt;C 불일치를 포함했습니다(표 1). SLAS-U의 ...

염기서열 특이적 핵산 분석을 위한 신호 리포터로 DNA 형광 라이트업 압타머를 활용하는 분할 혼성화 프로브

DNA-based fluorescent light-up aptamers (FLAPs) are promising for bioanalytical assays because they provide a low-cost fluorescent signal readout without ...

split-hybridization-probe-utilizing-dna-fluorescent-light-up-aptamer

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

분자 프로브 PicoGreen 염료와 microplate 리더 액세서리를 갖춘 히타치 F - 7000 형광 분광 광도계를 사용하여 dsDNA의 부량의 데모.

히타치 F - 7000 형광 분광 및 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량

이 비디오에서는 MCPyV 비리온에 감염된 세포를 현장 혼성화 연쇄 반응을 통해 MCPyV 특이적 게놈을 검출했습니다. 또한 DNA-HCR 기술을 FISH와 결합하여 감염된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 시각화했습니다.

HCR-DNA FISH: 감염된 세포에서 바이러스 DNA를 검출하기 위한 형광 현장 혼성화 기술

이 동영상은 mRNA 프로브를 특정 타겟 mRNA에 하이브리드화하는 것과 관련된 순차적 하이브리드화 전략을 설명합니다. 프로브 하이브리드화 후, 조직학적 샘플의 RNA-CISH 동안 신호 대 잡음비의 감소를 통해 분해능을 향상시키기 위해 신호 증폭이 수행됩니다.

RNA In Situ Hybridization에서 프로브 혼성화 및 신호 증폭: 조직 절편에서 특정 RNA 염기서열을 검출하는 기법

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

여기에서는 슬라이드 장착형 염색체에서 반복적인 이색성 염기서열을 시각화하기 위해 형광 DNA 제자리 혼성화(DNA ISH)를 수행하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 최소한의 시약만 필요하며 짧거나 긴 프로브, 다양한 조직, 형광 또는 비형광 기반 신호로 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

광안정 시아닌 염료는 올리고뉴클레오티드에 부착되어 에너지 전달에 의한 혼성화를 모니터링합니다.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

여기에서는 리가아제(ligase), 뉴클레아제(nuclease) 및 중합효소(polymerase enzymes)의 예를 사용하여 핵산 대사 효소를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 RNA 및/또는 DNA 손상 또는 경로 중간체를 모방하는 듀플렉스를 형성하기 위해 결합할 수 있는 형광 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 행동의 특성을 분석할 수 있습니다.

핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

핵산은 생물학적 시스템을 평가하기 위한 일반적인 분석물입니다. 그러나 효소 조작으로 인한 편향은 우려를 야기할 수 있습니다. 여기에서는 폴리아닐린을 사용하여 핵산을 표지 없이 검출하는 방법에 대해 설명합니다. 이 민감하고 비용 효율적인 센서 기술은 분자 간의 단일 뉴클레오티드 차이를 구별할 수 있습니다.

핵산 폴리아닐린 계 센서

배우세요 분할 혼성화 프로브를 이용한 DNA 형광 라이트업 압타머 기반 핵산 분석 방법을. DAP-10-42 신호 리포터로 단일염기 치환을 정확히 검출하고 무표지 형광 신호 판독이 가능합니다.

염기서열 특이적 핵산 분석을 위한 신호 리포터로 DNA 형광 라이트업 압타머를 활용하는 분할 혼성화 프로브

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