July 8th, 2025
이 프로토콜은 형광 라이트업 압타머 DAP-10-42를 신호 리포터로 사용하는 분할 혼성화 프로브의 설계와 핵산 검출 및 단일 뉴클레오티드 치환이 있는 표적 간의 구별을 위한 응용 프로그램을 간략하게 설명합니다.
우리는 서열 특이적 핵산 분석을 위한 새로운 유형의 형광 혼성화 프로브를 개발하고 있습니다. 가장 최근에는 CRISPR-Cas 시스템을 활용하는 분석으로 하이브리드화 분석 도구가 확장되었습니다. 현재 TaqMan과 같은 최첨단 하이브리드화 프로브 및 분자 비콘 프로브는 핵산 표적을 분석하는 데 가장 많이 사용됩니다.
단일 뉴클레오티드 치환 및 핵산 표적의 정확한 검출은 여전히 실질적으로 어렵습니다. 당사의 프로토콜은 라벨이 없는 형광 신호 판독을 제공하면서 필요한 수준의 세포 활동을 보장합니다. 시작하려면 SLAS를 구성하는 두 개의 변형되지 않은 DNA 올리고뉴클레오티드 가닥의 서열을 설계합니다.
DAP-10-42의 6 내지 39에 대해 뉴클레오티드를 함유하는 단편을 사용한다. 뉴클레오티드 1 내지 8 및 36 내지 42로 구성된 줄기 1을 위치 5에서 부풀어 오른 티민을 제거하고 줄기를 4개의 염기쌍으로 줄이고 말단 시토신-구아닌 염기쌍을 추가하여 줄기 1 프라임으로 변환합니다. 한 SLAS 가닥에 뉴클레오티드 9 내지 29를 포함하고 다른 SLAS 가닥에 뉴클레오티드 30 내지 35를 포함한다.
데옥시 GGTCAT을 첨가하여 뉴클레오티드 9에서 29로 단편의 3개의 프라임 말단 서열을 확장합니다. 그런 다음 데옥시 TGACC로 30 내지 35 단편의 5개 프라임 말단 서열을 확장하여 6-염기쌍 줄기 2를 형성합니다. 이제 데옥시 TT 링커와 핵산 표적에 상보적인 DNA 서열을 사용하여 두 가닥의 줄기 1 프라임을 확장합니다.
이렇게 하면 프로브를 구성하는 가닥 SLAS-U 및 SLAS-S의 시퀀스가 생성됩니다. SLAS-S를 7-10 뉴클레오티드 영역에 보완적으로 만듭니다. 여기에는 단일 뉴클레오티드 치환 부위가 포함됩니다.
그런 다음 SLAS-U의 표적 결합 암이 SLAS-S 영역에 인접한 15 내지 25 뉴클레오티드 단편에 상호적인지 확인합니다. UNAFold 웹 서버를 사용하여 표적 결합 이중체의 용융 온도를 평가합니다. INAMelt 탭을 클릭합니다.
응용 프로그램으로 이동하여 Two State Melting Hybridization을 선택합니다. 왼쪽 및 오른쪽 상자에 5개의 소수에서 3개의 소수 순서로 상호 작용하는 시퀀스를 입력합니다. 그런 다음 분석 온도를 섭씨 22도로 조정하고 1가 및 2가 양이온 농도를 각각 20밀리몰 및 25밀리몰 이온으로 입력합니다.
해당 상자에서 상호 작용하는 서열의 농도를 조정합니다. 제출을 누르고 해당 듀플렉스에 대한 Gibbs 에너지 변화, 엔탈피, 엔트로피 및 용융 온도 값을 검토합니다. 완벽하게 일치하는 표적과 SLAS-S 및 SLAS-U의 표적 결합 암의 용융 온도가 분석 온도인 섭씨 22도 이상인지 확인합니다.
SLAS-S와 일치하지 않는 표적 사이의 듀플렉스가 특이성을 유지하기 위해 분석 온도 이하의 용융 온도를 생성하는지 확인하십시오. 필요한 경우 이러한 조건에 맞게 대상 바인딩 암의 길이를 조정하십시오. 상업용 DNA 공급업체로부터 최종 SLAS-U 및 SLAS-S 올리고뉴클레오티드 가닥을 얻거나 자동 DNA 합성기를 사용하여 사내에서 합성합니다.
Auramine O, SLAS-S, SLAS-U 및 분석 완충액의 원액을 준비합니다. 표적을 제외한 모든 분석 성분을 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스의 마지막 5 x 6 부피에 뉴클레아제가 없는 물을 첨가합니다.
그런 다음 마스터 믹스를 소용돌이치고 회전시킵니다. 각 샘플 튜브에 50마이크로리터를 분배합니다. 다음으로, 한 샘플을 표적 없음 블랭크로, 다른 샘플을 양성 대조군으로 라벨을 붙입니다.
마스터 믹스가 들어 있는 튜브에 10마이크로리터의 표적 함유 샘플을 추가하여 60마이크로리터 샘플을 만듭니다. 블랭크의 경우 10마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 그런 다음 표적 서열을 포함하는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드 10마이크로리터를 양성 대조군 튜브에 피펫팅합니다.
미세 원심분리기를 사용하여 원심분리기에서 모든 샘플을 잠시 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 22도에서 10-60분 동안 배양합니다. 형광 분광 광도계를 사용하여 475나노미터에서 여기 시 540나노미터에서 형광을 측정합니다.
SLAS는 NANOGP8 유전자의 특정 단편을 표적으로 삼도록 맞춤화되었습니다. 표적 M은 SLAS-S 가닥에 완전히 상완적인 반면, 표적 MM은 시토신 뉴클레오티드 위치 1, 423을 가졌기 때문에 SLAS-S와의 불일치가 발생했습니다. 완전히 상호적인 표적 M을 추가하면 형광이 꾸준히 증가하고 45-50분 후에 정체되었습니다.
그러나 10의 신호 대 블랭크 비율로 10분 이내에 명확한 신호를 검출할 수 있었습니다. SLAS는 완전히 일치하는 표적에 대해 높은 형광 신호를 보였지만 일치하지 않는 표적 또는 블랭크에 대해서는 그렇지 않았습니다. 형광 출력은 최대 500나몰의 표적 농도에 따라 선형적으로 증가하여 검출 한계의 정량화 및 결정이 가능했습니다. PCR 증폭 샘플은 다양한 수준의 신호를 보였으며 샘플 2만 형광 임계값 2를 초과했습니다.
검량선을 기반으로 샘플 2의 NANOGP8 앰플리콘 농도는 124+ 또는 13 나노몰로 추정되었습니다. SLAS 신호의 형광 검출은 벤치탑 분광 광도계와 휴대용 형광계 모두에서 일관되었습니다. 20 이상의 신호 대 블랭크 비율도 UV 광선을 사용하여 육안으로 관찰되었습니다.
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이 프로토콜은 특정 핵산 분석을 위한 형광 혼성화 프로브의 개발을 설명하며, 신호 리포터로 DAP-10-42의 사용에 중점을 둡니다. 단일 뉴클레오티드 치환을 검출하는 데 있어서의 문제를 다룹니다.
Sequence-specific nucleic acid analysis using split hybridization probes with DNA fluorescent light-up aptamers (FLAPs) addresses the persistent challenge of detecting single-nucleotide substitutions with high specificity and quantitative confidence. This approach enables label-free, cost-effective, and scalable fluorescence-based readouts, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery and screening workflows. The method's selectivity and quantitative outputs are directly relevant for portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in biopharma R&D.
This split hybridization probe platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing, assay development, and translational biomarker validation.