살아있는 무표지 유방암 세포의 표현형 분석을 발전시키기 위한 다중 모드 이미징 프레임워크

이제 우리의 프로토콜은 고유의 생리학적 환경에서 인간 유방암 세포의 빠르고 편향되지 않은 형태화학적 표현형을 위해 공초점 라만 현미경 및 단층 촬영 위상 현미경을 사용하는 다중 모드 이미징을 제시합니다. 라만 현미경 분광법과 단층 촬영 위상 현미경을 결합하면 생리학적 조건에서 무표지 이미징이 가능해 세포에 대한 생화학적 및 형태학적 정보를 제공하고 형광 표지 또는 화학적 고정과 같은 기존 섭동 방법의 한계를 해결할 수 있습니다. 우리의 결과는 유방암 세포의 형태화학적 표현형을 제공하는 데 다중 모드 접근 방식을 구현할 수 있는 높은 잠재력을 보여줍니다. 또한, 다양성, 재현성 및 비침습성은 기초 세포 생물학 연구부터 진단에 이르기까지 광범위한 생물의학 응용 분야를 위한 유망한 도구가 되었습니다.

우리는 재생 의학 및 질병 연구를 발전시키기 위해 비침습적 배아 품질 관리, 세포 노화 검출 및 오가노이드 모델의 약물 스크리닝을 위한 광학 바이오마커 아틀라스를 만드는 것을 목표로 합니다.

[강사] 시작하려면 MDA-MB-231 인간 유방암 세포 샘플을 온스테이지 인큐베이터에 넣습니다. 침수 대물렌즈를 위해 물을 추가합니다. 자동 침수 피더를 켜서 대물 렌즈에 물을 공급합니다. 증발을 방지하기 위해 정기적으로 수위를 확인하고 측정 전반에 걸쳐 일관된 이미징 조건을 보장하십시오. 이제 펌프 레이저를 켜고 출력을 조정하여 샘플 평면에서 75밀리와트의 레이저 출력을 달성합니다. Micro-Manager 현미경 제어 소프트웨어를 엽니다. 구성 설정에서 BF를 선택하고 소프트웨어 창 왼쪽에 있는 라이브를 클릭합니다. 원하는 단일 셀을 선택한 다음 중지를 클릭하여 명시야 시각화를 종료합니다. CCD 카메라 제어 소프트웨어를 엽니다. 실험 설정에서 노출 시간을 1.5초로 설정합니다. 실험 도구 모음에서 실행을 클릭하고 레이저 빔을 켭니다. 그런 다음 Z 위치를 조정하여 지문 영역의 신호 수를 600에서 1,800 역센티미터로 최대화한 다음 레이저를 끕니다. 실험 도구 모음에서 중지를 클릭하고 소프트웨어를 종료합니다. 다차원 측정에서 라만 채널을 자동으로 관리하고 데이터를 저장하는 MATLAB 스크립트를 사용하여 데이터 수집 프로세스를 시작합니다. 시야각을 50 x 50 마이크로미터 정사각형으로 설정하고 해상도는 40 x 40 픽셀이며 각 픽셀은 1.25 x 1.25 마이크로미터 정사각형을 덮습니다. 각 라만 스펙트럼의 노출 시간을 1.5초로 설정하고 MATLAB 스크립트를 실행합니다. 라만 초분광 맵의 후처리를 위해 RamApp 웹 기반 도구를 실행합니다. 내 분석 탭에서 새로 만들기를 클릭하여 초분광 데이터를 가져오고 X축 변수와 함께 공간 및 스펙트럼 데이터 변수가 포함된 .mat 파일을 업로드합니다. 스펙트럼을 자르려면 자르기 및 회전 메뉴에서 스펙트럼 자르기를 선택합니다. 라만 이동 영역의 하부 및 상부 경계를 각각 600 및 1,800 역센티미터로 정의합니다. 우주선을 보정하려면 노이즈 제거로 이동하여 despike를 클릭하고 방법으로 Z-score를 선택하고 임계값을 8로 설정합니다. 첫 번째 차이 사용 및 수정 스파이크 옵션을 선택한 다음 실행을 클릭하여 수정을 적용합니다. 맵에서 노이즈를 제거하려면 스무딩 맵을 클릭하고 중앙값 필터를 선택한 다음 정사각형의 크기를 3픽셀로 설정한 다음 실행을 클릭합니다. 각 픽셀의 스펙트럼을 매끄럽게 하려면 Savistky-Golay 필터를 선택합니다. 필터 창 길이를 7로 설정하고 다항식 차수를 2로 설정한 다음 실행을 클릭합니다. 평균 배경 신호를 빼려면 광학 기판 제거를 열고 기판 식별을 클릭합니다. k-means를 두 개의 클러스터가 있는 방법으로 설정합니다. 그런 다음 고급 옵션을 클릭합니다. 형태학적 청소를 선택하여 전경에서 작은 블롭을 제거한 다음 실행을 클릭합니다. 평균 배경 신호를 제거하려면 기판 제거를 클릭한 다음 전체 평균 또는 값의 중앙 95% 평균을 선택하고 실행을 클릭합니다. 기준선 형광을 보정하려면 기준선 패널을 열고 올바른 기준선을 클릭한 다음 적응형 부드러움 PLS를 선택한 다음 람다를 500만 으로 설정하고 실행을 클릭합니다. 각 라만 초분광 맵의 정규화를 위해 기타로 이동하여 정규화를 선택하고 프로베니우스 방법을 선택한 다음 실행을 클릭합니다. 세포 내 분포를 보여주는 가색 이미지를 생성하려면 이미지 패널에서 강도 이미지 아래의 열기 메뉴 기호를 클릭한 다음 이미지 편집을 클릭합니다. 편집 패널에서 단일 대역을 선택하고 스펙트럼 범위를 정의합니다. 이제 컬러 맵에서 이중 색상을 선택한 다음 확인을 클릭하기 전에 색상, 강도 임계값 및 불투명도를 정의합니다. 단일 포인트 스펙트럼을 다운로드하려면 관심 픽셀을 선택한 다음 스펙트럼 범례 패널에서 스펙트럼 다운로드를 클릭합니다. 마지막으로 전경 및 기판 스펙트럼을 내보내려면 스펙트럼 범례로 이동한 다음 전경 및 기판 섹션 모두에 대해 스펙트럼 다운로드를 클릭합니다. 현미경의 대물 렌즈에 증류수 한 방울을 놓습니다. 현미경의 번역 단계에 샘플을 배치한 다음 샘플 위치를 조정하여 대물 렌즈와 정렬합니다. 현미경을 켜고 이미징 소프트웨어를 실행합니다. 도구 모음에서 현미경 아이콘을 클릭합니다. 초기화 후 구성을 클릭하고 작업 패널에서 라이브 셀을 선택하고 PBS를 매체로 선택합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어의 제어판에서 보정 탭에 액세스합니다. 초점과 표면을 각각 선택하여 대물렌즈와 콘덴서 렌즈의 축 위치를 설정합니다. 이제 스캔 모드를 클릭하여 렌즈를 수동으로 조정하고 조명 패턴이 중앙에 있고 거의 정적인지 확인합니다. 일반 모드를 선택한 다음 변환 단계를 조정하여 셀을 시야로 가져오고 샘플에 초점을 맞춥니다. 변환 단계를 조정하여 셀이 없는 영역을 찾습니다. 보정을 선택하여 다양한 조명 각도에서 여러 2D 홀로그램을 캡처합니다. 변환 단계를 조정하여 셀을 중앙에 배치한 다음 획득 탭으로 이동하여 3D 스냅샷을 선택하여 셀의 단층 촬영을 캡처합니다. 홀로그램 단층 촬영을 시각화하려면 데이터 탐색 패널에서 데이터를 선택하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭한 다음 열기를 클릭합니다. 데이터 관리자 패널에서 RI 단층 촬영을 클릭합니다. 볼륨 시각화 패널에서 RI를 선택하고 RI 캔버스 내에 4개의 직사각형 색상 상자를 그립니다. 각 색상 상자에 대한 RI 범위의 최소값과 최대값을 설정한 다음 불투명도와 색상을 각 상자에 연결합니다. 저장을 클릭하여 정의된 RI 범위와 색상 상자를 저장합니다. 세포 형태의 정량적 설명자를 얻으려면 분석 인터페이스를 활용하십시오. 세분화 패널에서 수동을 선택한 다음 1.3450을 RI 임계값으로 설정하고 적용을 클릭합니다. 저장을 클릭하여 계산된 형태학적 인덱스를 저장합니다. 라만 스펙트럼 매핑은 개별 MDA-MB-231 세포 내에서 세포질, 핵, 페닐알라닌 및 지질의 공간적 분포를 밝혔습니다. 세포질, 핵, 페닐알라닌 및 지질에 해당하는 뚜렷한 라만 스펙트럼 피크가 600에서 1,800 역센티미터 사이의 지문 영역에서 확인되었습니다. 단일 세포의 굴절률 히트 맵은 축 XY 평면, 시상 YZ 평면 및 관상 XZ 평면에서 세포 내 구성 요소의 내부 분포를 밝혔습니다. 3D 단층 촬영 재구성은 내부 하부 구조에 해당하는 체적 굴절률 영역을 식별했습니다. 단일 MDA-MB-231 세포의 정량적 형태학적 측정은 총 부피가 4024.189입방마이크로미터이고 표면적이 2383.707제곱마이크로미터이고 평균 굴절률이 1.356인 세포 형태의 다양한 설명자를 보여주었습니다.