Name: 생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 배우세요 Paramecium tetraurelia의 생체 내 근접 비오티닐화 방법을 통해 단백질 상호 작용을 연구하는 기법을. turboID 라이게이스를 이용한 이 프로토콜은 다양한 유전자에 신속하게 적용 가능하며 단계별 생물학적 표지가 가능합니다.

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<ol><li>Stefanov, B. -A., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+eukaryotic+RNA-guided+programmed+DNA+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination.</a> Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).</li>
<li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+and+epigenetic+control+of+programmed+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).</li>
<li>Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStefanov%2C+B-A+%22Epigenetics+in+Biological+Communication.+Witzany%2C+G%22">Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G</a>. , Springer Cham. 369-385 (2024).</li>
<li>Dubois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+invasion+of+the+paramecium+germline+genome+countered+by+a+domesticated+piggybac+transposase+and+the+NHEJ+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway.</a> Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).</li>
<li>Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiosis-specific+Spt5+homolog+involved+in+non-coding+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).</li>
<li>Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+Dicer-like+proteins+and+small+RNAs+required+for+genome+sculpting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting.</a> Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).</li>
<li>Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sets+of+piwi+proteins+are+involved+in+distinct+sRNA+pathways+leading+to+elimination+of+germline-specific+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA.</a> Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).</li>
<li>Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+noncoding+transcripts+antagonize+the+targeting+of+DNA+elimination+by+scanRNAs+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia.</a> Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).</li>
<li>Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+programming+of+developmental+genome+rearrangements+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia.</a> Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).</li>
<li>Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+noncoding+RNAs+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear noncoding RNAs and genome stability.</a> Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).</li>
<li>Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+Tetrahymena%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in Tetrahymena.</a> Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).</li>
<li>Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nowa1p+and+Nowa2p%3A+Novel+putative+RNA+binding+proteins+involved+in+trans-nuclear+crosstalk+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia.</a> Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).</li>
<li>Drews, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+piwis+with+Ago-like+functions+silence+somatic+genes+at+the+chromatin+level%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level.</a> RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISWI1+complex+proteins+facilitate+developmental+genome+editing+in+Paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium.</a> Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).</li>
<li>Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+expression%2C+solubility%2C+and+purification+of+a+passenger+protein+in+fusion+with+different+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags.</a> Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Beisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+clonal+Paramecium+tetraurelia+cell+lines+of+controlled+age+through+daily+reisolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).</li>
<li>Berger, J. D., Rahemtullah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+to+autogamy+in+Paramecium+blocks+mating+reactivity%3A+implications+for+regulation+of+the+sexual+pathway+and+the+breeding+system%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system.</a> Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).</li>
<li>Stefanov, B. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+protein+thermometer+enables+precise+electrothermal+control+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+proximity+labeling+with+enhanced+direct+identification+of+biotinylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites.</a> Commun Biol. 7 (1), 554(2024).</li>
<li>Leffers, K. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+natural+and+recombinant+prion+protein+into+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils.</a> Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+release+factor+1+from+Euplotes+promotes+frameshifting+at+premature+stop+codons+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells.</a> iScience. 27 (4), 109413(2024).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarker-driven+feedback+control+of+synthetic+biology+systems+for+next-generation+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunlight-Controllable+Biopharmaceutical+Production+for+Remote+Emergency+Supply+of+Directly+Injectable+Therapeutic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins.</a> Small. 18 (41), e2202566(2022).</li>
<li>Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+ciliates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in ciliates.</a> Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>현미경 Axiovert 40 CFL (10x, 40x 렌즈)</td><td>자이스</td><td>나</td><td></td></tr><tr><td>b-시토스테롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>567152</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>CellTram 오일</td><td>에펜도르프</td><td>나</td><td></td></tr><tr><td>코돈 최적화 3xHA-turboID DNA 서열</td><td>트위스트 생명과학</td><td>나</td><td>GCTAGCTATCCATAcGAaGTTC CTGATTATGCTTATCCTTACGAT GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT GATGTACCTGATTACGCTGGATC AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC를 TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA AGAGCTGCTATTAATAAACACATT CAAACTTTAAGAGATTGGGGT TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT GACTCAACTAATCAATATTTATTAG ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG GTGATGCTGTATTGCTGAATACC AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTTT t GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT TGGTATTGTGTGGCTGAAGCTCT TAGAAAATTAGGTGCTGCATGATAAGGT TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT GTTATCGGTGCTGGTGTATTAATGTTG CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT · TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA TTAGAGAACACTTAGAGCTGCTTTAGA ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG GTGTTCAAACCATGGATGGGTGGT GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA GAAATGA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마 알드리치</td><td>디9542</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AAA151610B</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S. 마이크로로더 팁</td><td>에펜도르프</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>그로그 케미</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>펨토젯 4i</td><td>에펜도르프</td><td>나</td><td></td></tr><tr><td>펨토팁 II</td><td>칼리버 사이언티픽</td><td>5242957000</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>시그마 알드리치</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>어플리켐</td><td>10021259</td><td></td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG 항체, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>HA-tag(C29F4) 토끼 mAB</td><td>세포 시스템</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>인젝맨 NI 2</td><td>에펜도르프</td><td>나</td><td></td></tr><tr><td>라이트 미디엄</td><td>나</td><td>나</td><td>2.5 mM Na2HPO4 중 0.2x 밀싹 분말 용액</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마 알드리치</td><td>M8691</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>시그마 알드리치</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>페놀-클로로포름-이소아밀알코홀</td><td>시그마 알드리치</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>형광체 완충 식염수&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10722497</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 플러스 미디렙 키트</td><td>키아겐</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>리치 미디엄</td><td>나</td><td>나</td><td>2.5 mM Na2HPO4의 밀싹 분말 용액 1개</td></tr><tr><td>스트렙타비딘-FITC</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>11-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV 원심 필터&nbsp;</td><td>EMD 밀리포어</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>세척액</td><td>나</td><td>나</td><td>Volvic 물의 0.1% BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>밀싹 분말 용액</td><td>파인스 인터내셔널</td><td>나</td><td>앞서 설명한 대로 분말에서 20x 스톡으로 준비합니다(0.5g/10mL).</td></tr><tr><td>스트렙타비딘-HRP</td><td>앱캠</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘 코팅 마그나틱 비즈</td><td>시그마 알드리치</td><td>LSKMAGT02</td><td></td></tr><tr><td>풀다운용 용해 버퍼</td><td>나</td><td>나</td><td>50mM 트리스 pH 8; 150mM 나클; 0.5% 데옥시콜산나트륨; 1% 트리톤 X-100; 5 mM MgCl2; 2x cOmplete 프로테아제 억제제(Roche); &nbsp;</td></tr><tr><td>풀다운용 세척 버퍼 1</td><td>나</td><td>나</td><td>50mM 트리스 pH 8; 150mM 나클; 0.5% 데옥시콜산나트륨; 1% 트리톤 X-100; 5 mM MgCl2;</td></tr><tr><td>풀다운용 세척 버퍼 2</td><td>나</td><td>나</td><td>10 mM 트리스 pH 7.4; 150mM 나클; 0.01 % NP40; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>풀다운용 세척 버퍼 3</td><td>나</td><td>나</td><td>10 mM 트리스 pH 7.4; 150mM 나클;</td></tr></tbody></table>

생체 내 paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

In Vivo Proximity Biotinylation for Protein Interaction Studies in Paramecium tetraurelia

우리의 프로토콜은 표적 단백질 근처의 단백질에 공유 비오틴 변형을 도입하기 위한 단순화된 방법을 설명합니다. Paramecium (그림 1A). 이러한 비오티닐화된 단백질은 스트렙타비딘 풀다운을 사용하여 추가로 농축되고 질량 분석법을 사용하여 식별될 수 있습니다20. 이 방법의 실제 사용 사례를 보여주기 위해 프로토콜을 Nowa1 단백질에 적용했습니다. 이 단백질은 게놈 재배열 과정에 필수적이며 국소화에 동적 변화가 있습니다12. 초기 단계에서는 오래된 체세포 핵과 단편에 남아 있지만 나중에는 새로 발달하는 핵에 위치합니다. 특히, Nowa1 상호 작용 단백질의 태그 매개 농축에 대한 이전 시도는 실패했습니다(미발표 결과). 이는 풀다운 절차 중 최적이 아닌 조건에서 자가 응집을 유발할 수 있는 프리온 단백질 PrP27과 유사성을 지닌 복합 반복 때문일 수 있습니다21. 우리는 프로모터를 포함하는 업스트림 비코딩 영역과 함께 Nowa1 코딩 영역을 PCR로 증폭했습니다. 그런 다음 생성물을 코돈에 최적화된 turboID 인코딩 시퀀스(그림 1B). 순환 DNA의 주입으로 인한 이식유전자 유도 침묵을 피하기 위해 Paramecium, 벡터는 주입 전에 선형화되었습니다. 선형화 및 정제된 DNA를 이 프로토콜에 설명된 대로 체세포핵(MAC)에 미세 주입했습니다. 체세포핵의 어두운 영역 내에 갇힌 분산된 물방울이 성공적인 주사 중 일부(그림 1C). 그런 다음 세포 분열 중 세포에 의한 DNA의 성공적인 주입 및 증폭을 PCR로 확인했습니다. 예상대로, 세포의 40-50%는 Nowa1 구축물의 주입된 DNA에 대해 양성이었습니다(예상 제품 크기 685bp)(그림 2). 다음 단계는 주입된 DNA에 의해 암호화되는 단백질의 존재를 확인하는 것이었습니다. 수용자 벡터에는 삼중 HA 태그 옆에 있는 turboID 서열이 포함되어 있기 때문에 면역형광 염색을 사용하여 태그를 검출했습니다. 이를 통해 주입된 세포가 융합 단백질을 발현하고 있는지, 그리고 그것이 적절하게 국소화되었는지 확인할 수 있었습니다. 우리는 이전에 야생형 Nowa1 단백질에 대해 관찰된 바와 같이 두 개의 새로운 발달 핵에서 융합 단백질의 국소화를 보인 후기 단계 세포를 사용했습니다12. 주입된 개별 세포주는 서로 다른 수준의 융합 단백질(그림 3). 낮은 발현 수준은 감소된 배경이 바람직한 응용 분야에 도움이 될 수 있지만, 이 경우 최대 신호를 선택하고 가장 높은 발현을 보인 클론 2를 진행했습니다. 그런 다음 융합 단백질의 국소화를 추적하기 위해 다양한 발달 단계에서 샘플을 수집했습니다. 이 단백질은 처음에 오래된 체세포 핵에서 형성된 타래와 자가결혼의 초기 단계에서 분리된 핵 조각에 국한되었습니다. 핵 안라겐이 나타나자 융합 단백질은 이러한 새로운 발달 핵(그림 4). 서로 다른 단계에서 근위 프로테옴의 비오티닐화를 촉진하기 위해 IF에 대한 세포를 수확하기 전에 2시간 동안 500μM 비오틴으로 배양물을 보충했습니다. 우리는 형광 태그가 부착된 스트렙타비딘을 사용하여 IF 염색을 통해 비오틴 표지 단백질을 시각화했습니다. 관찰된 신호는 HA 태그가 붙은 융합 단백질의 국소화에 해당했습니다. 중요한 것은 비오틴과의 짧은 배양만으로도 상당한 비오티닐화를 달성하기에 충분하기 때문에 다양한 핵 발달 단계에 특이적인 비오티닐화 국소화를 얻을 수 있었다는 것입니다(그림 4). 또한, 보충 비오틴을 첨가하지 않고, 주입된 세포에서 무시할 수 있는 비오티닐화만 검출될 수 있었다. 야생형 세포에서 보충 비오틴의 첨가는 검출 가능한 비오티닐화를 일으키지 않았습니다(그림 5A). 특히, 비오틴은 변성 조건에서도 단백질에 부착된 상태로 남아 있기 때문에 단순히 발달 중인 핵에 축적되는 것이 아닙니다. (그림 5B). 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비드를 사용하여 비오티닐화된 단백질(그림 6). 농축된 단백질은 질량 분석법을 사용하여 식별할 수 있습니다. 이러한 후속 단백질 식별 실험에서, 보충되지 않은 배양물과 융합되지 않은 터보ID 단백질을 발현하는 세포를 배경 대조군으로 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig1.jpg"> 
그림 1: P. tetraurelia의 근접 비오티닐화 절차 개요. (A) 프로토콜의 일반화된 개요. (B) 플러그 앤 플레이 turboID 수용자 벡터 및 Nowa1 융합 단백질에 대한 결과 구조에 대한 복제 원리. 이 플라스미드에 사용되는 3'UTR 영역은 CenH3a에서 파생됩니다. (C) DNA의 성공적인 주입 시 체세포핵(MAC)에 해당하는 어두운 영역 내에 포함된 눈에 보이는 확산 물방울. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig2.jpg"> 
그림 2: 성공적인 주입을 위한 PCR 테스트. 암피실린 내성(amp start)을 암호화하는 업스트림 영역에 특이적인 순방향 프라이머와 Nowa1에 보완적인 역방향 프라이머가 있는 제품에 대한 PCR 반응의 아가로스 겔 분석. 화살촉은 예상 제품 크기를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig3.jpg"> 
그림 3: turboID 융합 단백질의 올바른 국소화를 검증하기 위한 면역형광 염색. Nowa1-HA-turboID 융합 단백질을 암호화하는 DNA에 대한 양성 PCR 신호가 있는 단클론 Paramecium 계통의 토끼-항-HA 1차 항체(1:100) 및 염소-항-토끼 Alexa Fluor 568 접합 2차 항체(1:1000)를 사용한 면역형광 염색. 스케일 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig4.jpg"> 
그림 4: 다양한 발달 단계에서 Nowa1 특이적 비오티닐화. 새로운 체세포 핵 형성 중 진행 단계에서 단클론 라인 2의 면역형광 염색. 배양 배지에는 최적의 터보ID 활성을 위해 500μM 비오틴이 보충되었습니다. HA-태그는 도 3과 같이 검출되었고, 비오틴은 Streptavidin-FITC(1:200)를 사용하여 검출되었습니다. 스케일 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig5.jpg"> 
그림 5: turboID에 의한 효율적인 근접 라벨링에는 배양에 보충 비오틴이 필요합니다. (A) Nowa1-HA-turboID의 발현 및 500μM 보충 비오틴으로 관찰된 비오티닐화를 보여주는 후기 발달 단계에서 wt 및 주입된 세포의 면역형광 염색. HA-태그와 비오틴은 그림 4와 같이 검출되었습니다. 스케일 20 μm. (B) 비오틴 유무에 관계없이 500μM 비오틴 및 turboID 주입 세포로 배양된 wt 세포의 HRP-스트렙타비딘을 사용한 비오틴에 대한 웨스턴 블롯 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig6.jpg"> 
그림 6: 스트렙타비딘 마그네틱 비드로 비오티닐화된 단백질의 농축. 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비드를 사용한 풀다운 실험에서 샘플의 비오틴에 대한 웨스턴 블롯 분석. 샘플은 Nowa1-HA-turboID 세포 용해물(입력), 결합되지 않은 분획(플로우스루), 세척 단계(세척 1-6) 및 비드에 결합된 단백질(출력)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

Paramecium is a major model organism for the study of molecular mechanisms involved in programmed genomic rearrangements and transposon elimination during ...

in-vivo-proximity-biotinylation-for-protein-interaction-studies

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

이 동영상은 선충 세포에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다. 관심 단백질의 근접성은 2차 항체에 부착된 PLA 프로브의 도움으로 원형 DNA 템플릿을 생성합니다. 프로브는 긴 단일 가닥 DNA를 생성한 후 검출기 프로브의 혼성화를 생성하는 증폭 용액을 사용하여 추가로 증폭되어 세포 내 단백질-단백질 상호 작용의 국소화를 가능하게 합니다.

In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

이 연구에서는 D. melanogaster 난소의 TurboID 기반 근접 표지(PL)에 대한 세부 프로토콜을 수립하여 비오틴 보충 및 난소 절제부터 이식유전자 발현 검증 및 질량 분석을 위한 비오틴화 펩타이드 농축에 이르는 단계를 다룹니다.

생체 내 Drosophila melanogaster에 TurboID 기반 근접 라벨링 적용

배우세요 Paramecium tetraurelia의 생체 내 근접 비오티닐화 방법을 통해 단백질 상호 작용을 연구하는 기법을. turboID 라이게이스를 이용한 이 프로토콜은 다양한 유전자에 신속하게 적용 가능하며 단계별 생물학적 표지가 가능합니다.

생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

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