표적 농축 워크플로우를 사용하여 임상 샘플에서 전체 박테리아 게놈 생성

게놈은 병원체의 조상, 전염 및 능력에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 배양할 수 없는 박테리아의 경우 이 정보는 표적 농축을 통해서만 얻을 수 있습니다. 임상 샘플에서 직접 박테리아 병원체의 시퀀싱은 압도적인 인간 DNA, 다양한 미생물군 및 극도로 낮은 박테리아 부하로 인해 어렵습니다.

많은 경우 샘플링 방법과 까다로운 박테리아로 인해 배양은 선택 사항이 아닙니다. 이 기술을 성병에 적용하면서 ompA-유전자형 L4라는 새로운 클라미디아 트라코마티스 LGV 계통을 발견하고 우세한 LGV 계통의 글로벌 확장을 확인하여 분자 진단 및 역학 감시에 대한 핵심 통찰력을 제공했습니다. 이 진행 농축 프로토콜은 양성 진단된 STI 임상 샘플에서 완전한 게놈 복구를 가능하게 합니다.

우리는 이 기술이 메타게놈 심층 시퀀싱, 숙주 DNA 고갈 및 나노포어 적응 시퀀싱보다 성능이 뛰어나다는 것을 발견했습니다. 우리는 유럽과 아르헨티나 전역에서 이러한 병원체의 순환 변종을 조사하고 있습니다. 이는 전염 및 항균 관리에 관한 정보를 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

시작하려면 민감하고 정확한 형광 기반 방법을 사용하여 임상 샘플에서 DNA 추출물의 DNA 농도를 측정합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 각 DNA 샘플을 각 PCR 튜브 스트립에서 17마이크로리터의 최종 부피에서 10 내지 200나노그램으로 희석합니다. 17마이크로리터의 희석된 DNA를 포함하는 각 웰에 3마이크로리터의 단편화 마스터 믹스를 추가합니다.

위아래로 20번 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 그런 다음 PCR 튜브 스트립을 밀봉합니다. 스트립을 10초 동안 고속으로 소용돌이치고 잠시 회전하여 내용물을 수집합니다.

그런 다음 PCR 튜브 스트립을 열 순환기에 넣고 단편화 및 배양을 위해 사전 프로그래밍된 프로토콜을 시작합니다. 다음으로, 표와 같이 엔드 리페어 및 dA-테일링 마스터 믹스를 준비합니다. 앞서 그림과 같이 튜브를 소용돌이치고 회전시켜 얼음 위에 보관합니다.

그런 다음 20마이크로리터의 말단 복구 및 dA-테일링 마스터 믹스를 50마이크로리터의 DNA 단편이 포함된 각 웰에 피펫팅합니다. 스트립을 밀봉하고 8초 동안 고속으로 소용돌이치게 합니다. 스트립을 잠시 회전시킨 후 열 순환기에 다시 넣습니다.

열 순환기 프로그램이 완료되면 PCR 튜브 스트립을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, DNA 단편을 포함하는 각 웰에 30 내지 45분 미리 준비된 실온 결찰 마스터 믹스 25마이크로리터를 첨가한다. NBC 태그 라이브러리용 어댑터 올리고 믹스 5마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.

즉시 PCR 튜브 스트립을 열 순환기에 다시 넣고 프로그램을 계속합니다. DNA 정제를 시작하려면 섭씨 4도에서 마그네틱 비드를 회수하고 사용하기 전에 실온에 도달시키십시오. 그런 다음 각 샘플 웰에 80마이크로리터를 추가합니다.

PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 놓고 200마이크로리터의 70% 에탄올로 각 웰을 두 번 세척합니다. 각 세척 중에 1분 동안 기다렸다가 마그네틱 비드를 방해하지 않고 에탄올을 조심스럽게 제거합니다. 비드를 35마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물과 5분 동안 혼합하고 배양한 후, 각 웰에서 제거된 상청액을 조심스럽게 흡인하고 새 PCR 튜브 스트립의 해당 웰로 옮깁니다.

새 PCR 튜브 스트립을 얼음 위에 놓고 마그네틱 비드를 버립니다. 준비된 사전 재포획 PCR 반응 혼합물을 가져와 정제된 DNA 라이브러리가 포함된 각 샘플 웰에 11마이크로리터를 추가합니다. 각 반응에 선택한 인덱스 프라임 복구 5마이크로리터를 추가하고 PCR 튜브 스트립을 밀봉합니다.

사전 캡처 PCR을 수행하기 위해 표에 지정된 대로 PCR 증폭을 위한 열 순환기 프로그램을 시작합니다. 열 순환기가 섭씨 98도에 도달한 후에만 PCR 튜브 스트립을 추가하십시오. 사전 캡처 PCR을 완료한 후 또 다른 비드 기반 클린업을 수행하여 라이브러리를 정제합니다.

PCR 산물을 마그네틱 비드로 배양합니다. 그런 다음 PCR 스트립 튜브를 자기 분리 장치에 놓고 용액이 투명해질 때까지 5-10분 동안 기다립니다. 스트립이 마그네틱 스탠드에 남아 있는 동안 각 웰에서 투명한 상청액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.

그런 다음 15마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 DNA를 용출하고 정제된 DNA 라이브러리의 DNA 농도를 측정합니다. 샘플 하이브리드화의 경우 여기에 지정된 프로토콜에 따라 열 순환기를 프로그래밍합니다. 프로그램을 시작하고 즉시 실행을 일시 중지합니다.

뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 준비된 DNA 라이브러리의 500 내지 1, 000 나노그램을 12 마이크로리터의 최종 부피로 희석합니다. 올리고뉴클레오티드 차단제 혼합물을 소용돌이치고 회전시킨 후 각 샘플 튜브에 5마이크로리터를 추가합니다. PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 열 순환기에 넣습니다.

프로토콜의 3단계에 도달하면 열 순환기를 일시 중지합니다. 준비된 실온 프로브 하이브리드화 혼합물 13마이크로리터를 각 샘플에 추가하고 스트립을 열 순환기 내부에 유지합니다. 천천히 위아래로 8-10회 피펫팅하여 혼합합니다.

기포가 없는지 확인하고 스트립을 열 순환기에 다시 넣습니다. 그런 다음 모든 튜브가 단단히 밀봉되어 있는지 확인합니다. 혼성화된 라이브러리를 캡처하려면 각 튜브의 전체 부피를 200마이크로리터의 사전 세척된 스트렙타비딘 비드가 들어 있는 해당 튜브로 옮깁니다.

스트렙타비딘 구슬을 실온 세척 완충액으로 세척하기 전에 수집하십시오. PCR 튜브 스트립이 자기 분리기에서 제거되면 섭씨 70도로 예열된 200마이크로리터의 고온 세척 완충액을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 비드를 다시 현탁합니다. 튜브 스트립을 밀봉하고 고속으로 소용돌이치고 앞에서 설명한 것처럼 빠르게 회전시킵니다.

밀봉된 튜브 스트립을 섭씨 70도의 열 순환기 블록에 넣고 5분 동안 배양합니다. PCR 튜브 스트립을 열 순환기에서 실온에서 자기 분리기로 다시 옮깁니다. 용액이 명확해질 때까지 1분 동안 기다리십시오.

그런 다음 상청액을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 그런 다음 비드가 들어 있는 각 튜브에 25마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 여기에 표시된 표에 지정된 대로 열 순환기를 프로그래밍합니다.

준비된 캡처 후 PCR 반응 혼합물 25마이크로리터를 각 샘플 튜브에 추가합니다. 현탁액이 균일해질 때까지 반응을 혼합하고 PCR 튜브 스트립을 회전시키지 않고 단단히 밀봉합니다. 밀봉된 PCR 튜브 스트립을 열 순환기에 넣습니다.

PCR 산물을 새 튜브로 옮긴 후 각 샘플 튜브에 50마이크로리터의 비드 현탁액을 추가하고 앞서 그림과 같이 DNA 정제를 수행합니다. 형광 기반 정량 방법을 사용하여 최종 정제된 라이브러리 DNA의 DNA 농도를 측정합니다. 표적 농축은 클라미디아 트라코마티스, 임질균, 트레포네마 팔리듐 및 마이코플라스마 제니탈리움을 포함하여 테스트된 모든 병원체에 대한 직접 시퀀싱에 비해 표적 판독의 비율이 상당히 높아졌기 때문에 완전한 게놈을 가져왔습니다.

게놈 시퀀싱 성공은 4가지 병원체 모두에 대해 qPCR 주기 임계값이 30 미만인 샘플에서 주로 관찰되었습니다. 클라미디아 트라코마티스에 대한 CT 값과 대상 판독 백분율 사이에 명확한 역상관관계가 있습니다. 이전 섭씨 65도에 비해 섭씨 62.5도의 혼성화 온도를 사용하여 다른 표적 병원체에 대한 성능을 저하시키지 않으면서 마이코플라스마 제니탈리움에 대한 게놈 범위를 개선했습니다.

아르헨티나의 클라미디아 트라코마티스 게놈에 대한 계통 발생 분석은 L2b 계통 내에 클러스터링된 많은 샘플을 보여주었고 약 600개의 단일 뉴클레오티드 다형성에 의해 이전의 모든 LGV 게놈과 분리된 ompA-유전자형 L4로 제안된 새로운 계통을 밝혔습니다.