바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

바이러스 감염은 세포 구조에 심각한 변화를 일으킬 수 있습니다. 이러한 변화를 3차원으로 시각화하기 위해, 우리는 바이러스에 감염된 세포의 영상을 위해 STEM 단층촬영을 사용합니다. STEM 단층촬영은 시간과 노동 집약적인 작업입니다.

이로 인해 바이러스에 감염된 샘플과 같은 생물학적 샘플 샘플에 대해 최적의 샘플 준비가 필수적입니다. 기존 STEM 단층촬영은 약 200나노미터 크기의 샘플 질병에 한정됩니다. 저희 프로토콜은 두꺼운 부분의 3D 영상 이미징을 가능하게 합니다.

이를 통해 바이러스 감염 세포와 초구조적 변화를 보다 포괄적으로 시각화할 수 있습니다. 많은 종양용해바이러스는 이미 임상 시험 단계에 있으며, 전 세계 연구자와 개발자가 협력하고 있으며, 과학은 암 치료의 경계를 넓히고 전자현미경과 STEM 단층촬영 같은 최첨단 기법이 새로운 통찰을 제공합니다. 우리는 STEM 단층촬영과 새로운 준비 프로토콜 및 기타 현미경 기법을 결합하여 바이러스학적 질문에 계속 답할 것입니다.

먼저, LN-박스에 액체 질소를 채워 고압 냉동 또는 HPF 홀더에서 저장 캡슐로 얼린 사파이어 디스크를 옮기고 다루기 위해 준비하세요. 냉동 과정 중에 LN-박스를 필요에 따라 채우기 위해 액체 질소가 담긴 듀어를 가까이 두세요. 단열 핀셋을 준비해 두세요.

HPF 후 사파이어 디스크를 담을 샘플 용기를 준비하세요. 뚜껑과 액체 질소를 부을 수 있는 여러 구멍, 그리고 뜨지 않도록 작은 추를 설치해 주세요. 라벨 용기를 LN 박스에 넣어 미리 식힌 후에 사용하세요.

그 다음 샘플을 인큐베이터에 넣으세요. 고압 냉동을 시작하기 전에 역광학 현미경으로 사파이어 디스크를 검사하여 충분한 세포와 좋은 세포 품질을 확인하세요. HPF를 수행하려면 배양 접시에서 사파이어 디스크 하나를 꺼내 필터 페이퍼에 빠르게 두드려 과잉 매체를 제거합니다.

디스크를 HPF 홀더에 넣고 탄소 코팅된 면이 위를 향하게 하여 숫자 2가 읽히도록 하세요. 금 스페이서를 헥사데케인에 담가 사파이어 원반 위에 부드럽게 올려놓으세요. 스페이서 위에 두 번째 사파이어 디스크를 올려놓고, 탄소 코팅된 면이 아래를 향하게 하여 셀들이 서로를 향하게 샌드위치 구성을 만듭니다. 공기가 갇히지 않도록 하세요.

HPF 홀더를 조심스럽고 빠르게 닫아 샘플에 가해지는 스트레스를 줄이세요. HPF 홀더를 고압 냉동고에 삽입하세요. 제조사 지침에 따라 잠그고 냉동 과정을 시작하세요.

다음으로 HPF 홀더를 LN-박스로 옮깁니다. 그 다음 사파이어 디스크를 담은 팁을 미리 냉각한 LN 박스로 옮깁니다. 조심스럽게 디스크를 홀더에서 꺼내세요.

자유 치환 용액이 채워진 밀폐 크라이오 바이알을 영하 90도까지 미리 냉각한 자유 치환 장치에 넣습니다. 용액이 같은 온도에 도달할 때까지 기다립니다. 핀셋, 메스, 펜치, 또는 액체 질소에 담근 큰 핀셋을 미리 냉각하여 사파이어 디스크를 옮길 때 사용합니다.

고압 냉동 샘플을 자유 치환 장치로 옮기세요. 사파이어 원반을 하나씩 분리하면서 액체 질소에 보관하세요. 그리고 각 디스크를 자유 대체 용액이 포함된 냉동 바이알에 빠르게 옮겨 디스크가 완전히 침수되도록 하세요.

냉동 바이알을 닫은 후 즉시 자유 치환 장치에 다시 넣으세요. 모든 샘플을 놓으면 치환 과정을 시작하세요. 샘플이 20도에 도달하면,

샘플을 30분씩 100% 아세톤으로 세 번 세척하세요. 샘플을 미리 삽입하려면 샘플을 1/3 에폭시 수지와 3분의 2 아세톤에 1시간 동안 인큐베이팅합니다. 샘플을 3분의 2가 에폭시 수지, 1/3 아세톤으로 1시간 배양한 후, 용액을 100% 에폭시 수지로 교환한 뒤, 다음 날 남은 아세톤이 증발하도록 바이알 뚜껑을 열어 하룻밤 배양한 후, 사파이어 디스크를 새로 표시된 반응관에 새로 준비한 에폭시 수지로 옮깁니다.

디스크를 튜브 벽에 의해 수평으로 지지하도록 위치시키고, 셀이 있는 쪽이 위를 향하도록 하세요. 그 후 뚜껑을 열어 반응관을 60도 오븐에 넣고 수지가 최소 48시간 동안 중합되도록 합니다. 에폭시 수지가 중합된 후, 닫힌 반응관 끝을 약 10초간 액체 질소에 담가둡니다.

테이블 위의 반응관을 두드려 수지 블록을 분리하세요. 사파이어 원반은 탄소 코팅과 쉽게 분리되며, 탄소 코팅은 내장된 셀에 부착된 상태로 남아 있습니다. 임베디드 샘플에서 관심 영역을 선택하고 관심 영역으로 표본 크기를 좁힙니다.

다이아몬드 나이프를 이용해 폴리-L-라이신 처리된 글로터스 하전 평행 막대 그리드에 약 1마이크로미터 두께의 단면을 수집하여 STEM 영상 및 STEM 단층촬영을 수행합니다. 콜로이드 금이 있는 단면을 기준 표지로 처리하고 탄소 코팅을 적용하세요. 초박쇄면을 절단하고 검사한 후, 샘플은 영상 촬영을 위해 준비됩니다.

연구 질문에 따라 밝은 필드 검출기, 암흑장 검출기 또는 둘 다 삽입하세요. 스캔 모드를 활성화하고 샘플의 테스트 이미지를 확보하세요. 최종 원하는 배율보다 더 큰 800,000배 이상의 배율을 선택하세요.

관심 영역 근처에서는 초점을 조정하고 난시를 교정하되, 중요한 샘플 영역에 직접 빔 노출을 피하세요. 이심 높이를 설정해 관심 영역(ROI)이 틸트 범위 전체에 걸쳐 중심을 유지하도록 하세요. ROI 근처의 특징을 선택하고 중심에 가져가 초점을 맞추고, 난시를 교정한 뒤 스테이지를 -72도로 단계적으로 기울이세요.

시야를 선택하려면 ROI로 돌아가 초점을 맞추고 전면 이미지를 캡처하세요. 틸트 시리즈 획득을 위해 최종 배율을 설정하세요. 자동으로 틸트 시리즈 이미지를 설정하는데, 영하 72도에서 플러스 72도까지 1.5도마다 이미지를 촬영합니다.

자동 기울임 시리즈 획득을 시작하세요. STEM 서열그램에서 나온 대표적인 가상 단면들은 비리온 방향이 2차원 뷰에서 특징적인 탄환 모양의 가시성에 어떤 영향을 미치는지를 보여주었습니다. 관측면과 평행하게 정렬된 비리온만이 탄환의 형태가 완전히 명확하게 정의된 형태를 보였고, 다른 비리온들은 기울기 각도에 따라 원형이나 길게 보였다.

2D 영상의 방향 한계를 극복하기 위해 STEM 단층촬영을 사용하여 출아 재조합 소포성 구내염 바이러스 바이러스 바이러스 비리온을 대량으로 포착하여 방향성 편향 없이 3차원에서 비리온 형태를 평가할 수 있게 했습니다. 열화상그램의 측면 모습은 STEM 단층촬영이 단일 600나노미터 두께 단면에서 많은 완전한 비리온을 포착할 수 있다는 부피적 이점을 확인시켜 주었으며, 이는 200나노미터 TEM 단면의 제한된 샘플링과 대조적이었습니다.