이중 양식 분자 지도 제작: 다중 mRNA 검출과 단백질 이미징 질량 세포 분석의 통합

우리는 난소암의 분자 기전을 더 깊이 이해하기 위해 특수 생물학에 집중하며, 환자의 생존을 예측할 새로운 치료 표적과 바이오마커를 찾고자 합니다. 현재 IMC의 과제 중 하나는 저함량 단백질의 해부, 항체 검증 및 조절의 노동, 그리고 분석 중 복잡하고 시간이 많이 드는 픽셀 분류입니다. 먼저 준비된 FFPE 슬라이드에서 과도한 액체를 제거하세요.

습도 조절 트레이를 오븐에서 꺼내고, 슬라이드 홀더를 트레이에 넣으세요. 그 후 RNA-ISH 증폭기 3을 완전히 보류시키고, 슬라이드의 각 조직 부위를 완전히 덮을 만큼의 시약을 추가합니다. 트레이를 닫고, 하이브리드다이제이션 오븐에 40도 섭씨에서 30분간 넣으세요.

배양 중에는 각 올리고를 1:15 비율로 희석하여 금속 올리고뉴클레오타이드 혼합물을 준비합니다. 금속 올리고를 완전히 섞은 후 실온에 두고, 추가 사용 전까지 실온에 두세요. 이제 오븐에서 습도 조절 트레이를 꺼내세요.

트레이에서 슬라이드 홀더를 빼서 트레이를 다시 오븐에 넣으세요. 그 다음, 슬라이드를 뉴클레아제가 없는 물로 미리 세척한 투명 슬라이드 홀더에 넣습니다. 슬라이드를 세척 버퍼에 넣고 2분간 약간 저어주세요.

슬라이드에서 남은 액체를 제거한 후, 습도 조절 트레이를 오븐에서 꺼내고 슬라이드 홀더를 트레이에 넣으세요. 각 조직 절편을 완전히 덮기 위해 미리 준비한 혼합 금속 올리고뉴클레오타이드를 추가하세요. 이제 트레이를 완전히 닫고, 하이브리다이제이션 오븐에 40도 섭씨에서 45분간 넣어주세요.

하이브리드다이제이션 오븐에서 습도 조절 트레이를 제거하고, 슬라이드 홀더를 꺼내 빈 트레이를 오븐에 다시 넣으세요. 비특이적 결합 부위를 차단하려면 슬라이드의 각 조직 절편을 완전히 덮을 만큼 충분한 블로킹 버퍼를 추가하고, 슬라이드를 실온에서 30분간 배양합니다. 슬라이드가 배양되는 동안, 항체 희석제 버퍼를 사용해 항체 혼합물을 희석하여 준비합니다.

배양이 끝나면 조직 슬라이드에서 버퍼를 버리고, 미리 준비된 항체 혼합물을 충분히 분사하여 조직 절편을 완전히 덮습니다. 그 후 슬라이드를 습기 챔버에 넣고 4도 섭씨에서 하룻밤 동안 부화시킵니다. 신선한 이리듐 인터칼레이터 용액을 준비하려면, RNase 없는 TBS를 사용해 500마이크로몰 스톡 용액에서 1:2,000 희석액을 만듭니다.

슬라이드를 뉴클레아제가 없는 물로 미리 세척한 투명 슬라이드 홀더에 넣고, TBS-T 버퍼에서 5분간 약간 저어주며 세척합니다. 그 후 슬라이드에 염색을 입히기 위해 준비한 이리듐 작업 용액을 넣고 실온에서 5분간 배양합니다. 그 후 슬라이드를 뉴클레아제가 없는 물로 미리 세척한 투명 슬라이드 홀더에 넣으세요.

슬라이드를 TBS-T 버퍼에 두 번 가볍게 저으며 5분간 세척하세요. 그 후 슬라이드를 이중 증류수에 빠르게 담가 TBS가 조직에 결정화하는 것을 방지합니다. 슬라이드를 화학 후드 아래에서 10분간 건조시킨 후 이미지 획득 전까지 섭씨 4도에서 보관하세요.

준비된 슬라이드를 영상 질량 세포검사 시스템의 소작실에 적재합니다. 관심 지역을 식별하기 위해 슬라이드의 파노라마 이미지를 촬영하세요. 이미지 획득 소프트웨어를 사용해 파노라마 이미지에서 관심 있는 영역을 표시하세요.

이미지 획득 소프트웨어에서 획득 템플릿을 적용하세요. 그리고 샘플 종류에 따라 레이저 출력을 조절하세요. 이제 레이저 소작 과정을 시작하세요.

검출기를 사용해 각 동위원소의 양을 측정하여 데이터를 디지털 형태로 변환하여 분석합니다. CD8 T 세포의 활성화 상태는 mRNA와 단백질 수준에서 그란자임 B의 공동 검출과 인터페론-감마 양성 반응을 통해 평가하였다. 암 관련 섬유아세포는 MFAP5 단백질과 POSTN mRNA를 발현하는 것으로 나타났으며, 이 두 가지 모두 암 관련 섬유아세포 공격성을 나타내는 지표입니다.

CD4 T 세포가 IL17A와 IL6 mRNA를 공동 발현하는 것으로 나타났으며, 이는 TH17 세포 동일성과 일치합니다. CD4 T 세포가 IL13 mRNA를 발현하는 것이 관찰되었습니다. 케라틴 양성 CD47 양성 종양 세포가 CD8 T 세포 근처에서 발견되었습니다.

활성화된 CD8 T 세포가 CD25 단백질을 발현하는 것으로 나타났습니다. 금속 결합 프로토콜과 형광 표지 프로토콜 간 THBS2와 CD47의 유사한 mRNA 염색이 관찰되었습니다.