폐암의 동계 동소 마우스 모델을 생성하기 위한 최소 침습적 방법

현재 연구는 폐암 질환을 이해하고 항암치료, 방사선치료, 면역치료를 포함한 표준 치료와 호환되는 새로운 치료 기법 개발에 중점을 두고 있습니다. 초기 폐암을 구체적으로 연구할 기준을 정립한 정형전소 폐암 모델을 찾지 못했습니다. 우리는 이 프로토콜을 통해 그 격차를 해소하기 위한 명확하고 재현 가능한 지침을 제공하기 위해 노력합니다.

이 프로토콜은 최소 침습이며 시행이 간단합니다. 또한, 제공한 기준을 바탕으로 이 프로토콜은 정밀 종양 착상의 선별을 가능하게 하며, 생물발광 영상을 통한 조기 종양 발견을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 숙주 조직 내 초기 폐암을 연구할 수 있게 하여, 새로운 암 치료제의 전임상 발전과 종양 미세환경 연구를 가능하게 합니다.

우리는 이 기법을 사용하여 흥미로운 새로운 폐암 치료법의 기전과 효능을 전임상 단계에서 평가하고, 향후 환자 치료에 도움이 되기를 희망합니다. 먼저, 마취된 쥐를 코 콘에 엎드린 자세로 온열 장치 위에 올려놓고, 양쪽 눈에 안부 연고를 바릅니다. 마취가 확인되면, 전기 클리퍼로 쥐 왼쪽 등쪽 2x3cm 크기의 직사각형 부위에 있는 털을 제거하세요.

척추에서 내측, 테이블을 측면으로, 마지막 갈비뼈는 아래로, 견갑골의 윗부분은 머리 쪽으로 면도하여 털이 보이지 않을 때까지 깎습니다. 쥐를 빈 우리에 넣어 온열 장치를 설치하세요. 쥐가 다시 의식을 되찾을 때까지 호흡 패턴을 관찰한 후 수술을 받을 때까지 다시 우리로 돌려보내세요.

세포 채취 당일, 수집 3시간 전부터 3시간 전에 겐타마이신 50밀리그램/밀리리터가 포함된 신선한 배지를 배양판에 추가하세요. 배양판에서 배지를 흡인하고 부착된 세포를 1x PBS로 세척합니다. 그 후 세포를 트립신 EDTA 용액과 함께 37도 섭씨에서 1분에서 2분간 배양합니다.

트립신을 중화시키기 위해 신선한 배지를 추가하세요. 플레이트를 부드럽게 두드리거나 피펫팅하여 세포를 분산시키세요. 그 다음 셀 현탁액을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 모으세요.

이제 원뿔형 튜브를 1,200G에서 실온에서 3분간 원심분리합니다. 바닥에 콤팩트 펠릿이 있는지 확인한 후, 상정액을 흡인하고 PBS로 펠릿을 세척합니다. 세척된 세포 펠릿을 PBS에 재현탁하여 약 100만에서 200만 세포/밀리리터 농도로 만들어 계수합니다.

진행 전에 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 걸러내세요. 다음으로, 세포 현탁액 10마이크로리터와 트리판 블루 10마이크로리터를 혼합합니다. 염색된 샘플을 혈구계에 넣고 세포 수를 세세요.

세포 총 수와 세포 생존 가능성을 계산하세요. 세포를 1,200G에서 상온에서 3분간 원심분리한 후 펠릿에서 나오는 PBS를 빼냅니다. 세포 펠릿을 PBS에서 0.5밀리그램/밀리리터의 메트라 겔에 재현탁합니다.

총 주입 부피 50마이크로리터 내에서 원하는 셀 수에 맞게 조정합니다. 세포 부유액은 얼음 위에 올려 마트리젤 굳어짐을 막으세요. 마취된 동물의 수술 부위를 멸균 거즈로 세 번 세척하며, 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 사용하세요.

멸균된 창구형 수술용 커튼을 쥐 위에 3x4cm 크기의 개구부를 두고, 그 위에 오토클레이브 수술기를 펼쳐 놓습니다. 겸자를 사용해 견갑골의 두개골 가장자리와 흉부 갈비뼈의 코들 가장자리를 식별합니다. 외과의사의 엄지와 검지로 피부를 팽팽하게 잡은 상태에서, 10사이즈 메스를 사용해 견갑골 바로 아래에 5밀리미터 정도의 표면 피부 절개를 합니다.

그 다음 115밀리미터 직선 가위로 갈비뼈와 늑간근에서 피하 지방을 무딘 채로 제거하면서도 절단하지 마세요. 모세혈관 손상으로 인한 가벼운 출혈을 막으려면, 멸균된 면 팁이 달린 어플리케이터를 출혈 부위에 가볍게 누르세요. 마이크로 광고기와 겸자를 사용해 절개 부위를 열어두세요.

일곱 번째 진갈비뼈부터 시작해 곡선형 중앙 포인트 겸자를 사용해 위로 세어 네 번째와 다섯 번째 갈비뼈를 찾으세요. 이 부위를 주입 부위로 표시하세요. 이제 셀 현탁관을 부드럽게 세 번에서 네 번 뒤집어 섞어주세요.

주사 직전, 50마이크로리터의 현탁액을 멸균된 300마이크로리터 31게이지 8밀리미터 인슐린 주사기에 흡입하여 기포가 없도록 하세요. 4밀리미터 두께의 멸균 금속 테이프를 주사기에 플러스팅하여 마개와 주입 깊이 조절 역할을 합니다. 50마이크로리터 세포 현탁액을 4번과 5번 갈비뼈 사이 늑간, 네 번째 갈비뼈 바로 아래에 90도 각도로 주입하고, 바늘을 2초에서 3초간 고정합니다.

바늘을 천천히 꽂은 각도와 같은 각도로 빼서 날카로운 용기에 버리세요. 마지막으로, 피부 절개를 2에서 3개의 사각형 매듭 봉합으로 봉합하고, 상처 봉합을 강화하기 위해 수의학적 외과용 접착제를 봉합 위에 바릅니다. 생물발광 영상은 실험용 마우스에서 주사 후 하루 만에 종양 관련 신호를 감지했으며, 쥐당 25,000 및 50,000 세포 그룹에서 광사도가 시간이 지남에 따라 눈에 띄게 증가했으며, 50,000 세포 그룹에서 더 높은 강도가 관찰되었습니다.

총 종양 플럭스는 25,000 세포군과 50,000 세포군 모두에서 기하급수적으로 증가했으며, 50,000 세포 그룹에서는 21일째에 10의 10 곱하기 8 광자의 제곱에 달했습니다. 가짜 쥐는 해리된 폐에서 발광이나 눈에 띄는 종양이 없었으나, 실험 쥐는 높은 발광과 폐 조직에서 붉은 종양 덩어리를 보였다. 주사 후 21일째에 포함된 쥐들은 주변 부위로의 침범이 없는 왼쪽 폐엽에 종양이 국한된 상태를 보였다.