교모세포종 동물 모델에서 간질액의 종단적 수집을 위한 뇌 개방형 미세관류 사용

우리는 뇌종양 간질액 내 질병 진행과 치료 반응에 기여하는 용해성 신호 전달 성분을 특성화하고 있습니다. 뇌종양 간질체 내 절대 용질 농도를 평가하는 것은 정교한 실험적 방법을 활용해야 하는 연구적 도전 과제로 남아 있습니다. 우선, 멸균 메스로 두개골 표면을 따라 시상형 중앙선 절개를 하고, 눈 사이에서 시작해 8에서 10mm 정도 후쪽으로 확장합니다.

그 다음 멸균 겸자를 사용해 정중 절개 부위의 피부를 측면으로 당깁니다. 브레그마와 람다가 모두 보이도록 하고, 필요하다면 절개 부위를 확장하세요. 다음으로 멸균 메스로 골막을 절개하고 겸자로 조직을 측면으로 당깁니다.

멸균된 면촉 어플리케이터로 1%에서 3%의 과산화수소를 발라서 두개골 표면을 깨끗이 청소하세요. 이제 0.3에서 1.0밀리리터 인슐린 주사기를 사용해 두개골 표면에 20에서 40마이크로리터의 자가 부식 치과용 접착제를 고르게 바릅니다. 그 다음 치과용 경화광에 노출시켜 접착제를 에칭하세요.

경화되면 멸균된 면 팁 어플리케이터와 식염수로 과도한 접착제를 닦아내세요. 드릴 비트를 cOFM 가이드 좌표로 재배치하세요. 드릴을 분당 15,000회전으로 설정하고 DV 마이크로매니퓰레이터 다이얼로 버 홀을 뚫으세요.

드릴링 중에는 두개골 두께를 자주 모니터링하고, 생리적 식염수로 세척하여 이물질을 제거하고 열을 줄이세요. 각 앵커 스크류 좌표에서 드릴 절차를 반복하세요. 이제 멸균 겸자와 멸균 드라이버를 사용해 1에서 2 실 깊이까지 삽입할 때까지 앵커 스크류를 설치하세요.

그 다음 cOFM 가이드와 더미 어셈블리를 가이드 홀더에 장착하고 홀더를 입체 고정 프레임에 부착하세요. 가이드 팁을 버 홀 위에 위치시키고, 분당 1밀리미터로 미리 정해진 깊이까지 천천히 내립니다. 시멘팅제를 두개골에 얇고 균일한 층으로 바르며, cOFM 가이드와 나사 아래 주변에 덮습니다.

치과용 경화등으로 각 층을 단단하게 만들고 다음 층을 붙이세요. 시멘트가 부품 사이 전체 공간을 덮도록 하고, 잠금 쐐기(locking wedge)는 피하세요. 가이드 홀더를 cOFM 가이드에서 분리한 후 마이크로매니퓰레이터의 DV 노브를 사용해 천천히 들어 올립니다.

겸자를 사용해 cOFM 가이드와 더미 어셈블리에서 잠금 쐐기를 제거하세요. 가이드에서 더미를 부드럽게 들어 올립니다. ML과 AP 마이크로매니퓰레이터 노브를 사용해 주사기 주입 인서트 어셈블리를 cOFM 가이드 위에 정렬하세요.

DV 노브를 사용해 주입 인서트를 내리고, 고정 쐐기를 겸자로 단단히 다시 삽입해 고정하세요. 이제 주사기에서 분당 1마이크로리터씩 3마이크로리터의 세포 현탁액을 주입하세요. cOFM 가이드 주변 지역을 모니터링하여 세포 현탁 배출물이 조립체에서 빠져나가지 않는지 확인하세요.

핀셋을 사용해 가이드와 인퓨전 인서트 조립체에서 잠금 쐐기를 제거하세요. 그 다음 DV 조절 노브를 이용해 가이드에서 인퓨전 인서트를 조심스럽게 들어 올립니다. 밀폐 유리 주사기를 사용해 밀고 당기는 튜브 라인에 인공 뇌척수액을 미리 채웁니다.

마이크로퍼퓨전 펌프의 펌프 헤드에 연동 튜빙 부분을 설치하세요. 퍼퓨세이트 백을 루어 락 커넥터로 푸시 튜빙에 연결하세요. 그 다음 플랜지 커넥터로 샘플링 인서트를 튜빙에 연결하세요.

긴 입구 축은 푸시 튜빙의 출력 끝에, 짧은 출구 축은 풀 튜빙의 입력 끝에 연결하세요. 연결된 샘플링 삽입물을 750마이크로리터의 인공 뇌척수액이 담긴 멸균 마이크로 원심분리관에 넣습니다. 분획 수집기 바늘을 플랜지가 있는 튜빙 커넥터를 이용해 당김 튜브 출력선에 연결하세요.

그 후 분당 10마이크로리터로 20분간 튜빙 플러시를 하여 공기 방울을 제거하세요. 다음으로, 가스 밀폐 주사기를 사용해 인공 뇌척수액을 풀 튜브 라인에 미리 채웁니다. 미세관류 펌프의 펌프 헤드에 연동 튜빙을 다시 설치하세요.

플랜지가 있는 튜빙 커넥터로 샘플링 인서트를 다시 연결하세요. 인렛은 풀 튜빙의 출력 끝에, 출구는 풀 튜빙의 입력 끝에 연결하세요. 인서트를 750마이크로리터의 인공 뇌척수액이 담긴 멸균 마이크로 원심분리관에 넣으세요.

남은 공기 방울을 제거하기 위해 분당 10마이크로리터로 20분 동안 튜빙 시스템을 세척하세요. 적절한 크기의 재킷에 마취된 동물을 입히세요. 팔 구멍을 완전히 통과시키고 재킷을 동물의 등에 단단히 고정하세요.

가이드와 더미 조립체에서 잠금 쐐기를 제거하려면 집게를 사용하세요. 그런 다음 더미 인서트를 조심스럽게 가이드에서 빼세요. 샘플링 인서트를 가이드에 조심스럽게 설치하고 잠금 쐐기를 다시 삽입하세요.

마취에서 동물을 제거하고 회전 케이지 시스템에 넣으세요. 우리 줄을 동물 재킷에 연결하고 회전 우리 시스템을 작동시키세요. cOFM 샘플링 후에는 회전 케이지 시스템을 비활성화하고 동물 재킷에서 케이지 테더를 분리합니다.

이제 집자를 사용해 가이드와 샘플링 인서트 조립체에서 잠금 쐐기를 제거하세요. 샘플링 인서트를 조심스럽게 가이드에서 빼낸 다음, 더미 인서트를 부드럽게 다시 가이드에 넣고 잠금 쐐기를 다시 삽입하세요. 동물 재킷 뒷부분의 고정장치를 분리하고 조심스럽게 재킷을 동물에서 벗기세요.

생물발광 영상을 통해 cOFM 가이드에 의한 종양 세포 착립을 통해 동물에서 종양이 존재함을 확인하였습니다. cOFM 샘플링된 간질액의 단백질체 주성분 분석은 테모졸로마이드 처리군과 디메틸 설폭사이드 처리군 간에 뚜렷한 분리를 보여주었습니다. 전지구 대사체 신호 분포는 테모졸로마이드와 디메틸 설폭사이드 샘플 사이에 거의 완벽하게 겹쳤습니다.

신호 중복에도 불구하고, 대사체 화산 분석 결과는 테모졸로마이드에 의해 뚜렷한 이동이 나타났다. 동일한 동물들의 대사체 값을 정량적으로 비교한 결과, 재순환 구성이 상대적 대사물 비율을 유지하면서 분석 물질 농도를 개선하는 것으로 나타났습니다. 뇌종양 미세환경 내 상대적 영양소 가용성은 아직 잘 알려져 있지 않습니다.

이 프로토콜은 이 격차를 해소하기 위해 사용되고 있습니다. 종양 미세환경 내 영양소 가용성과 신호 전달을 특성화하면 교모세포종 진행 기전과 치료에 대한 적응 저항성을 밝혀낼 수 있습니다.