이종이식에서 급성 세포 및 항체 매개 거부반응을 연구하기 위한 3인 워크플로우를 가진 표준화된 마우스 모델

본 연구는 급성 세포성 및 항체 매개 거부 반응의 기전을 연구하기 위한 표준화된 소동물 이종이식 모델에 초점을 맞춥니다. 기존 모델들은 흔히 시술자의 숙련도에 따라 결과가 달라지거나 폐 시술 과정에서 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 본 프로토콜은 신속하고 표준화되었으며 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

이 그림은 수술자가 수혜자 준비, 공여자 심장 적출 및 공여자 심장 문합을 동시에 수행하는 마우스 이종 이식의 표준화된 3인 워크플로우를 보여줍니다. 우선, 생후 10~12일 된 neonatal sprayed dolly 랫드와 7~8주 된 C57 Black 6 또는 BALB/c 마우스를 준비합니다. 모든 공여자 랫드와 수혜자 마우스는 특정 무균(SPF) 환경에서 사육하십시오.

포비돈 요오드에 적신 솜 뭉치로 마취된 쥐의 흉복부 영역을 소독합니다. 가위로 복부를 절개합니다. 그런 다음 면봉을 사용하여 장을 조심스럽게 옆으로 밀어 하대정맥을 노출시킵니다.

인슐린 주사기를 사용하여 0.2 내지 0.5 milliliters의 헤파린 처리된 식염수를 하대정맥에 주입합니다. 출혈을 방지하기 위해 면봉으로 주입 부위를 가볍게 압박합니다. 횡격막을 절개합니다.

흉벽을 양측으로 절개하고 이를 젖혀 심장을 완전히 노출시킵니다. 그 다음 흉선을 제거하고 상대정맥을 절단하여 압력을 완화합니다. 심정지를 유도하기 위해 University of Wisconsin 용액 1 mL를 대동맥에 관류합니다.

심장이 붉은색에서 창백한 색으로 변할 때까지 관류를 계속합니다. 심장의 온도를 낮추고 탈수를 방지하기 위해 얼음처럼 차가운 식염수에 적신 거즈 패드를 심장 위에 놓습니다. 8.0 실크 봉합사로 상대정맥과 하대정맥을 결찰합니다.

두 혈관을 모두 절단합니다. 그런 다음 대동맥궁에서 대동맥을 절단합니다. 폐동맥의 분지 지점에서 폐동맥을 절단합니다.

8-O 실크 봉합사로 모든 폐정맥을 결찰합니다. 그런 다음 공여자 심장을 적출합니다. 적출한 심장을 일시적으로 보존하기 위해 얼음처럼 차가운 생리식염수에 넣습니다.

제모 크림을 사용하여 마취된 수혜 마우스의 목 부위 털을 제거합니다. 포비돈 요오드와 알코올을 이용하여 피부를 각각 세 번씩 번갈아 가며 소독합니다. 수술용 칼을 사용하여 목의 정중선에서 오른쪽으로 약 1cm 떨어진 지점에 2cm 길이의 종적 절개를 실시합니다.

둔성 박리를 통해 피하 지방과 근육층을 제거합니다. 턱밑샘을 절제합니다. 외경정맥을 노출시킨 후, 저응고 모드로 설정된 전기소작기로 분지들을 개별적으로 소작합니다.

결찰을 위해 정맥의 말단 부근에 8.0 실크 봉합사 두 개를 배치합니다. 그런 다음 미세수술용 가위(microsurgical scissors)를 사용하여 두 결찰점 사이의 외경정맥을 절단합니다. 외경정맥을 정맥 커프(venous cuff)에 삽입하고 커프를 정맥의 기저부까지 밀어 넣습니다.

그 다음 혈관 겸자로 고정합니다. 미세수술용 가위를 사용하여 결찰사를 제거하십시오. 그런 다음 헤파린 처리된 식염수를 사용하여 정맥에서 잔류 혈액을 씻어냅니다.

미세 수술용 포셉을 사용하여 외경정맥을 커프 위로 뒤집어 올린 후 8.0 실크 봉합사로 고정합니다. 흉쇄유돌근 후면을 둔성 박리하여 경동맥집을 찾습니다. 경동맥집을 절개하여 엽니다.

총경동맥을 내경정맥 및 미주신경으로부터 조심스럽게 분리합니다. 다음으로, 경동맥을 결찰하고 절단합니다. 그런 다음 절단된 동맥의 하단을 동맥 커프(arterial cuff)에 삽입합니다.

동맥을 커프 위로 뒤집어 고정합니다. 공여측 대동맥을 수혜측 경동맥의 동맥 커프 위로 밀어 넣습니다. 8.0 silk 결찰사로 이를 고정합니다.

공여측 폐동맥 주위에 느슨한 매듭 고리를 만듭니다. 수혜측 외경정맥의 정맥 커프 위로 폐동맥을 밀어 넣습니다. 그런 다음 실크 결찰사로 고정합니다.

수혜자의 경동맥과 외경정맥에 설치된 혈관 클램프를 제거하여 혈류를 복원합니다. 공여 심장이 10초 이내에 강력한 수축을 재개하며 빠르게 붉은색으로 변하는 것을 관찰합니다. 공여 심장의 리듬이 안정되면 심장의 위치를 조정합니다.

4.0 봉합사를 사용하여 목의 피부 절개 부위를 봉합합니다. 포비돈 요오드로 수술 부위를 소독합니다. 체온 유지를 위해 37 to 38 °C로 유지되는 따뜻하고 부드러운 패드 위에 마우스를 놓습니다.

마우스가 의식을 회복할 때까지 관찰하십시오. 마우스가 완전히 깨어나면 먹이와 물을 충분히 섭취할 수 있는 케이지에 개별적으로 수용하십시오. BALB/c 수용군에서의 이식편 생존 기간 중앙값은 4일이었습니다.

반면 C57 Black 6 수혜자의 경우, 이는 6.5일까지 유의미하게 연장되었습니다. SD-to-BALB/c 군의 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과, 광범위한 적혈구 유출을 동반한 심각한 심근 파괴가 관찰되었습니다. SD-to-C57 Black 6 군의 헤마톡실린 및 에오신 염색에서는 주로 염증성 침윤이 특징인 심근 손상이 나타났습니다.

SD-to-BALB/c 군의 면역형광 염색 결과, CD3 양성 T-세포 침윤과 CD68 양성 대식세포 침윤은 매우 적었으며, C4D 침착은 광범위하고 강하게 나타났습니다. SD-to-C57 Black 6 군의 면역형광 염색 결과, CD3 양성 T-세포 침윤이 두드러졌고, CD68 양성 대식세포 존재와 C4D 침착은 중간 수준으로 나타났습니다. 평균 성공률은 3인 그룹에서 93.3%였으며, 1인 그룹의 86.7%와 대비되었습니다.

팀 상관관계, 숙달 연습, 원형화 및 안정적이고 정형화된 현대적 체계의 보장이 주요 과제입니다. 향후 연구에서는 이 표준화된 모델을 사용하여 이식편의 면역 기전을 조사하고, 일반적인 면역 억제 또는 내성 유도 기간을 평가할 수 있습니다.