스캐폴드 프리 마우스 난소 난포 배양을 위한 맞춤형 아가로스 몰드의 생산 및 사용

저희 연구는 맞춤형 생리 모합 및 스캐폴드 없는 난포 배양 방법을 개발하여 시험관 내 배양 난포와 그로 인한 난자의 질을 향상시킬 수 있는지 확인하는 것을 목표로 합니다. 현재 가장 발전된 배양법은 하이드로겔 캡슐화된 시험관 내 난포 성장 시스템을 사용하여 난포가 난포 형성 과정에서 3차원 구조를 유지할 수 있도록 합니다. 수소 캡슐화는 기술적으로 도전적이고, 번거롭고, 처리량이 적으며, 안타깝게도 자동 영상 방법과는 호환되지 않습니다.

또한, 3D 캡슐화는 생체 내 생리학을 모방하지 않는 균일한 지지를 제공합니다. 우리는 난자의 매우 민감한 세포를 지원하는 3D 프린팅 생체 적합성 몰드를 만들었습니다. 스캐폴드 없는 환경에서 자란 난포는 기존 기법에 비해 호르몬 생성을 저해하지 않으면서 성장과 배란이 개선되었습니다.

우리는 모낭의 자연 환경을 더 잘 모방할 수 있는 사용자 친화적이고 맞춤화 가능한 배양 시스템의 필요성을 해결하고 있습니다. 타임랩스 영상은 또한 난포 성과를 실시간으로 추적하고 분석할 수 있게 해줍니다. 우선, 컴퓨터 시스템에서 CAD 소프트웨어를 실행하세요.

소프트웨어에서 24웰 마스터 몰드 베이스 설계 단계 파일을 열어보세요. 객체의 내부 표면적을 선택하세요. 그 다음 디자인 작업 공간의 솔리드 탭으로 이동해 '스케치 생성'을 선택해 원하는 마이크로몰드 디자인을 삽입하세요.

이제 원하는 x와 y 차원과 마이크로웰의 개수를 도입합니다. 그 다음 툴바에서 Finish Sketch를 선택하세요. Solid, Create, Extrude를 차례로 선택하여 Extrude 기능을 사용하여 800마이크로미터 깊이의 마이크로웰을 생성합니다.

이제 디자인, 솔리드, 수정, 필레를 클릭하여 마이크로웰 상단에 0.1밀리미터 반경의 필렛을 선택하세요. 0.25밀리미터 반경의 필렛을 추가하여 둥근 바닥 마이크로웰을 만듭니다. 새 마스터 몰드 디자인을 저장하고 파일을 선택한 후 내보내기를 눌러 단계별 형식으로 복사본을 내보내세요.

24웰 실리콘 캐스트 용기 1단계 파일을 열어보세요. 그 후 저장된 파일을 우클릭하여 '현재 설계에 삽입'을 선택하여 새 마스터 몰드 디자인을 외부 부품으로 삽입하세요. 다음으로, 삽입된 부품을 우클릭하여 Break Link를 선택하여 마스터 몰드 설계에 대한 참조를 제거하세요.

새로운 마스터 몰드 디자인을 24웰 실리콘 캐스트 용기 안에 한 면을 중앙에 배치하여 안쪽을 향하도록 합니다. 객체를 정렬하려면 확인(OK)을 선택하세요. 절단 작업을 선택하고, 컨테이너를 타겟 바디로, 마스터 몰드를 공구 바디로 사용하여 실리콘 몰딩 캐비티를 만듭니다.

새로 나온 24웰 실리콘 몰드 파일을 STL과 스텝 파일로 저장하고 내보내세요. 3D 프린팅 준비 소프트웨어를 사용해 새로운 24웰 실리콘 몰드 1과 24웰 실리콘 주조 컨테이너 2의 STL 파일을 열어보세요. 마이크로필러가 위를 향하도록 출력물을 정렬하고, 드릴 구멍 기능을 사용해 출력물 옆면에 1밀리미터 너비의 구멍을 만듭니다.

두 용기 설계를 25마이크로미터 두께의 층으로 출력하세요. 완성된 출력물은 제조사 지침에 따라 세척하세요. 그 다음 마이크로필러 부분에 95% 이소프로판올을 대량으로 뿌리세요.

남아 있는 에탄올은 압축 공기로 제거하세요. 건조 및 경화 후에는 입체 현미경으로 각 출력물을 점검하세요. 모든 미세기둥이 분리되어 크기와 외관이 균일하게 유지되도록 주의 깊게 확인하세요.

경화 후에는 드릴 채널이 채워지지 않았다면 출력물 외부에 파라필름을 바르고 추가 사용 때까지 보관하세요. 다음으로, 준비된 실리콘을 진공 건조기에 5분간 넣어 기포를 제거합니다. 실리콘 혼합물을 균일한 흐름으로 3D 프린팅된 몰드에 부어, 평평하게 만들기 위해 밀드 표면과 같거나 약간 낮게 유지되도록 합니다.

P200 피펫 팁으로 갇힌 공기를 제거하고 필요하면 다시 가스를 제거하세요. 실리콘은 실온에서 건조기에서 최소 5시간 이상 또는 가능하면 하룻밤 동안 경화하세요. 경화 후에는 몰드에서 실리콘을 제거하고 입체 현미경으로 마이크로몰드를 검사합니다.

드릴 채널에서 남는 물질을 제거하고, 브리징 또는 손상된 우물이 있는 몰드는 폐기하세요. 다음으로, 실리콘 몰드를 두 번째 몰드 용기에 넣어 측면 개구부가 정렬되었는지 확인해 두 번째 몰딩 단계를 진행하세요. 실리콘 몰드에 배아 안전 미네랄 오일을 가볍게 뿌리세요.

압축 공기를 사용해 마이크로웰에 남은 과도한 오일을 제거하세요. 실리콘 혼합 과정을 반복한 후 새 혼합물을 두 번째 용기에 부어 몰드 표면 아래에서 수평을 유지합니다. 다음 날, 실리콘을 3D 프린팅 몰드에서 분리하고, 실리콘 몰드를 서로 분리하세요.

현미경으로 검사한 후, 미세기둥이 손상되거나 유정 내 과도한 기름이 있는 몰드는 버리세요. 이제 실리콘 몰드를 70% 에탄올로 세척하세요. 층류 후드 안에서 30분간 자연 건조시킵니다.

마르면 몰드를 멸균 파우치에 넣고 오토클레이브합니다. 난포 이식 시 정밀도를 높이기 위해 스트리퍼 끝을 약간 구부리세요. pH나 온도 변화를 막기 위해 난포를 빠르게 옮겨야 합니다.

현미경 아래에서 200마이크로미터 스트리퍼 팁을 사용해 미세몰드당 10개의 다층 2차 모낭을 옮겨 인접한 마이크로웰에 배치합니다. 10개의 난포 크기가 비슷한지 확인한 후 설치를 마무리하세요. 다음으로, 휴대용 현미경에 라이트 포커스터 캡을 장착하세요.

현미경 마운트를 인큐베이터에 삽입하고, 소프트웨어가 있는 노트북에 연결하세요. 현미경 아래에서 배양물을 잘 위치시키고 정렬한 뒤, 모든 난포가 보이도록 높이와 초점을 조절하세요. 자동 화이트 밸런스, AWB, LED 제어를 사용하세요.

자동 노출, AE를 끄고 최적 노출 시간을 선택하세요. 8일 간격 30분의 타임랩스 영상 촬영을 시작하세요. 사진을 선택하고 사진을 찍지 않을 때는 LED를 끄세요.

아가로스 마이크로몰드에서 배양된 난포는 지속적인 성장과 구강 형성을 보였다. 배란 유도 후, 아가로스 마이크로몰드에서 배양한 난포는 알지네이트 난포보다 더 많은 배란된 난자를 생산했습니다. 생체 적합성을 추가로 입증하는 것으로, M2 난자의 방추 형태는 그룹 간에 유의미한 차이가 없었습니다.

알지네이트 캡슐화된 난포는 배양 중 위치를 유지하지 못했으며, 타임랩스 영상 촬영과는 호환되지 않습니다. 타임랩스 영상 촬영 중에는 페렛의 직경, 원형도, 종횡비 등 개별 난포 형태를 배양 기간 동안 즉시 추적하고 측정할 수 있었습니다. 광학 일관성 단층촬영은 내부 난포 구조의 3D 시각화를 가능하게 했으며, 배란 중 동적 난포 파열 사건도 포착했습니다.

아가로스 마이크로몰드는 파라핀 삽입 및 절절 후 같은 평면의 여러 난포를 조직학적으로 분석할 수 있게 하여 조직의 존재 여부와 H&E 염색을 지원할 수 있게 했습니다. 이 방법의 맞춤화 가능성을 입증하기 위해, 금형당 10개의 마이크로웰을 특징으로 하는 96웰 용량의 고처리량 버전이 만들어졌고, 성공적으로 제작되었습니다. 24웰 설계와 마찬가지로 난포의 타임랩스 영상과 호환되었습니다.