크론병 유사 회장염 및 섬유증의 SHIP 결핍 마우스 모델에서 치료 개입 평가

우리는 SHIP 결핍 쥐를 이용해 크론병에서 장 염증과 섬유증을 유발하는 기전을 연구하고, 크론병 치료를 위한 신약 또는 치료 전략을 평가합니다. 그래서 우리는 이 모델을 전임상 연구에서 활용하여 글리코겐 IBD 약물의 표적 약물 전달 효능을 입증했습니다. 우리 프로토콜은 SHIP 결핍 마우스를 사용하는데, 이들은 자연스럽게 회장 염증과 섬유화를 발병시키기 때문에, 전통적인 화학적 유발 또는 손상 기반 모델보다 생리학적으로 더 적합한 모델을 제공합니다.

우리의 연구 결과는 SHIP 결핍 쥐를 회장 염증과 섬유증의 견고한 모델로 입증하여, 크론병 치료법의 기전적 연구와 전임상 시험을 가능하게 합니다. 우선, 분석하기 전에 쥐를 4시간 동안 단종시킵니다. 멸균 PBS에 4킬로달톤 FITC-덱스트란을 용해하여 최종 농도인 80밀리그램/밀리리터에 도달합니다.

다음으로, 각 마우스를 부드럽게 제압하고 경구 개비지로 FITC-덱스트란 용액 150마이크로리터를 투여한 후, 개베지 후 4시간 더 먹이지 않고 가둔 상태입니다. 쥐를 안락사 시킨 후에는 25게이지 바늘과 1밀리리터 주사기로 심장 천자를 하여 혈액을 채취합니다. 즉시 100마이크로리터 혈액마다 항응고제로 산-시트레이트-덱스트로스 용액 10마이크로리터를 첨가하세요.

튜브를 여러 번 뒤집어 완전히 섞으세요. 수집된 혈액 샘플을 1,500G에서 4도 섭씨에서 10분간 원심분리합니다. 혈장을 라벨이 붙은 1.7밀리리터 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮기세요.

모든 샘플은 분석 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 차폐하세요. 이제 PBS를 사용해 각 혈장 샘플을 1:2, 1:10 비율로 희석합니다. 각 플라즈마 희석액을 100마이크로리터를 불투명한 96웰 플레이트에 추가하여 중복 웰에 배치합니다.

PBS를 사용해 원래 80밀리그램/밀리리터 FITC-덱스트란 스톡을 1회에서 2회 연속 희석하여 다양한 농도의 용액을 준비합니다. 각 희석액을 100마이크로리터씩 96웰 플레이트의 복제된 웰에 추가합니다. 그 다음, 여기 485 나노미터, 방출 시 535 나노미터로 설정된 마이크로플레이트 리더를 사용해 형광을 측정합니다.

혈액 채취 후 FITC-덱스트란 검사를 위해 쥐의 소장 전체를 신중하게 절제하세요. 장에 붙어 있는 지방과 결합 조직을 부드럽게 제거하세요. 깨끗이 씻은 장을 흰 빈 종이 위에 평평하게 펴서 시각적 대비를 강화하세요.

SHIP 녹아웃 마우스의 염증이 흔히 발생하는 10센티미터 말단 부위에 특히 주의를 기울여 조직을 육안으로 검사하여 병의 거시적 징후가 있는지 확인하세요. 장을 자와 함께 정렬해 크기를 파악하고, 전체 표본을 사진으로 촬영해 심각한 병리학적 소견을 기록하세요. 주사기로 장 내강을 부드럽게 세척하여 장내용물을 제거하되, 융모와 납골부 구조의 변형을 방지하기 위해 과도한 힘을 주지 마세요.

원위 회장의 주요 병리를 가장 대표하는 부위를 확인하고 약 1센티미터의 조직을 절제합니다. 절제된 조직을 조직학 카세트에 평평하게 놓고 두 개의 스펀지 사이에 끼워 고정 시 접히는 것을 방지합니다. 헤마톡실린과 에오신 염색 및 마손 삼색염색 시에는 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고, 조직 부피의 10배에서 20배에 하룻밤 4도 섭씨에서 고정합니다.

고정 후에는 카세트를 70% 에탄올로 옮겨 보관하고, 가공 전까지 완전히 잠겨 있도록 하세요. 알시안 블루와 주기산-쉬프 염색을 위해서는 조직을 카르노이 용액에 4도 섭씨에서 하룻밤 고정하세요. 고정 후에는 카세트를 100% 에탄올로 옮겨 보관하여 처리할 때까지 보관합니다.

그 후 고정된 조직을 파라핀에 박고 다섯 마이크로미터 조각으로 나누어 이후 염색합니다. 헤마톡실린 및 에오신 염색된 회장 절개는 정의된 조직병리학적 기준에 따라 16점 척도를 사용하여 채점합니다. 미리 정의된 기준에 따라 6점 척도로 마송 삼색 염색 단면을 평가합니다.

최종 섬유증 점수를 두 명의 독립 평가자가 실험 조건에 눈을 가린 채 부여한 점수의 중앙값으로 계산합니다. 조직학 샘플을 해리 및 제거한 후, 회장의 원위 10센티미터 남은 부분을 채취합니다. 수집된 조직을 종이 타월이나 보풀 없는 물티슈로 닦아낸 후, 보정된 저울로 조직 무게를 기록하세요.

조직을 액체 질소에 급속히 동결한 후 영하 80도에서 보관하여 향후 가공을 위해 보관합니다. 가공 준비가 되면 냉동 조직을 꺼내 항상 얼음 위에 보관하세요. 그 후 조직 샘플을 다시 무게를 재고 정확한 질량을 확인합니다.

PBS에 프로테아제 억제제를 첨가하여 균질화 버퍼를 준비합니다. 조직 밀리그램당 10마이크로리터의 완충제를 사용하세요. 벤치탑 균질기를 사용하여 얼음처럼 차가운 균질화 완충제에서 전층 회장 조직을 균질화합니다.

균질세포가 균일하고 보이는 조직 조각이 없을 때까지 계속합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 PBS로 균질기 팁을 충분히 헹구세요. 조직을 10,000G에서 4도에서 10분간 균질화하는 원심분리기.

정액된 상청액을 더 작은 부피로 나누어 동결-해동 사이클을 방지한 후, 향후 분석을 위해 영하 80도에 보관합니다. 조직학적 분석 결과, SHIP 결핍 마우스에서 SHIP 대조군에 비해 유의하게 더 큰 장 손상이 발생하였습니다. 덱사메타손 치료는 SHIP 결핍 마우스에서 조직학적 손상을 감소시켰으나, 통계적으로 유의미하지는 않았습니다.

Masson의 삼색 염색은 SHIP 결핍 마우스에서 SHIP 대조군에 비해 콜라겐 침착이 유의하게 증가하여 섬유증 점수가 더 높음을 나타냈다. 덱사메타손 치료는 SHIP 결핍 마우스에서 섬유화를 현저히 감소시켜 점수를 SHIP 양성 대조군에 더 가깝게 만들었습니다. 알시안 블루 및 PAS 염색 검사를 통해 SHIP 결핍 마우스에서 잔 세포 과형성이 확인되었으며, 덱사메타손 치료 후 눈에 띄게 감소했습니다.

SHIP 결핍 마우스에서 IL-1 베타 농도는 SHIP 대조군에 비해 유의하게 높았습니다. 덱사메타손은 SHIP 결핍 마우스에서 IL-1베타 농도를 유의하게 감소시켰습니다. SHIP 결핍 마우스에서 MPO 농도는 SHIP 대조군에 비해 유의하게 높았으며, 덱사메타손으로 인해 통계적 유의성에 이르지 못한 증가가 감소했습니다.

SHIP 결핍 마우스에서도 LCN-2 농도가 높았으나, 덱사메타손에 의해서도 높은 수치가 일관되게 감소하지는 않았다. IL-1 베타 농도는 조직학적 손상 점수와 섬유증 점수와 양의 상관관계를 보이며, 염증과 조직 손상 간의 연관성을 나타냅니다. 조직학적 손상 점수는 섬유증 점수와 양의 상관관계를 보였으며, 이는 조직 손상과 섬유화 재형성이 병행하여 진행되었음을 시사합니다.