조기 암 발견을 위한 맞춤형 단백질 코로나 프로파일링을 위한 표준화된 SDS-PAGE 워크플로우

우리는 나노입자가 혈액과 상호작용하여 초기 암 징후를 발견하는 과정을 연구하며, 간단하고 재현 가능하며 주로 비침습적인 진단 검사를 목표로 합니다. 먼저, 그래핀 옥사이드 나노 시트의 4밀리그램당 1밀리리터 스톡 용액을 초순수수에 희석하여 원하는 농도로 희석합니다. 희석된 용액을 28% 진폭으로 2분간 초음파 처리하며, 펄스 설정은 8초 켜지고 6초 끄는 방식으로 균일한 분산을 보장합니다.

분산된 용액의 농도를 자외선 가시광선 분광법으로 정량화합니다. 그 후 633나노미터 헬륨 네온 레이저를 이용한 동적 광산란을 이용해 용액의 유체역학적 크기와 제타 전위를 측정합니다. QVet 검출 한계에 따라 초순수수에 샘플을 희석하세요.

다음으로, 필요에 따라 상업용 동전 건조된 인간 혈장을 초순수한 물로 희석합니다. 재구성된 플라즈마를 18, 620G에서 4도에서 15분간 원심분리합니다. 상청액을 수집하여 영하 80도에서 보관하여 추가 사용 전까지 보관하세요.

이제 비신코닌산 분석법을 사용해 단백질 농도를 정량화하여 혈장 희석을 조절하고 최적의 나노입자와 혈장 비율을 결정합니다. 선택된 나노입자 부피를 플라즈마와 혼합하여 두 물질의 목표 비율을 달성합니다. 혼합물을 37도 섭씨에서 1시간 동안 배양하세요.

단백질 코로나를 분리하기 위해, 나노입자 혈장 샘플을 18,620G, 섭씨 4도에서 15분간 원심분리합니다. 생성된 펠릿을 초순수 200마이크로리터로 세척하세요. 그 후 다시 부유하고 원심분리기를 사용하세요.

최종 세척 후에는 나노입자 단백질 복합체 분리의 증거로 콤팩트 펠릿의 존재를 확인한다. 다음으로, 환원제, 로딩 버퍼, 물을 혼합하여 계산된 로딩 버퍼 부피에 도달합니다. 준비된 로딩 버퍼에 펠릿을 다시 매달아 넣으세요.

그 다음 현탁액을 100도 섭씨에서 10분간 끓입니다. 끓인 샘플을 18, 620G, 섭씨 4도에서 15분간 원심분리합니다. 상정액을 새 튜브에 모으세요.

이제 염색되지 않은 버퍼에서 분자량 표준을 염색된 버퍼와 희석하여 단백질 사다리를 준비합니다. 트리스-글리신-SDS 버퍼 10개를 1x 농도로 희석하세요. 전기영동 챔버를 4%에서 20%의 얼룩 없는 그라디언트 젤로 조립하세요.

그 후 제조사가 권장하는 수준에 도달할 때까지 버퍼를 부어줍니다. 각 우물에 10마이크로리터의 샘플을 주입하세요. 그 다음 각 웰에 7마이크로리터의 사다리를 피펫팅합니다.

젤을 150볼트로 실온에서 약 90분간 돌립니다. 젤 이미지를 스크립트와 같은 폴더에 tiff 파일로 저장하세요. 그 다음에는 개방 젤 현상을 합니다.

m은 MATLAB에서 진행됩니다. 젤 이미지 이름을 이미지 이름으로 입력하세요. 그 다음 한 사다리 차선의 인덱스를 인덱스 마커로 입력합니다.

대본을 실행하세요. 단계의 완료 사항이 명령 창에 표시되며, 화면에 네 개의 창이 나타납니다. 이제 원본 젤 이미지가 위에 있고, 아래쪽에 비스듬한 레인 효과에 대한 보정이 있는 그림 1을 엽니다.

왼쪽 보정과 오른쪽 보정 값을 수정하여 보정 매개변수를 조정하세요. 그림 2를 열어. 위쪽에는 사선 차선 효과를 보정한 이미지와 하단에 제거된 배경 이미지가 포함되어 있습니다.

스크립트에서 BKG par X 값을 조정해서 배경 제거를 조정하세요. 그림 2에서 모든 식별된 차선이 수직 흰색 선으로 표시되어 있음을 관찰하세요. 이제 왼쪽에 검출된 피크와 오른쪽에 R 제곱 값이 있는 비선형 맞춤이 포함된 마커 레인의 강도 프로파일을 포함한 그림 3을 엽니다.

사다리 레인에 예상되는 밴드 수가 피팅 절차에 사용된 탐지된 피크 수와 일치하는지 다시 한 번 확인하세요. 그 다음 겔 내 모든 검출된 레인에 대한 정규화된 강도 프로필이 포함된 그림 4를 엽니다. 내보내기 매개변수를 1로 설정하면 Excel 파일에서 분자량 함수로 강도 프로파일을 내보내세요.

대본을 실행하세요. 완료 후에는 작업 폴더에 분자량 함수로 절대 프로파일과 정규화된 프로파일을 포함하는 엑셀 시트가 첫 번째 열에 생성됩니다. 그 다음 젤 프로필 프로 M 파일을 열고 스크립트를 실행하세요.

화면에 네 개의 창이 뜨게 됩니다. 5번 그림 상단에는 절대 강도 프로필, 하단에는 각 레인별 총 강도가 표시되어 있습니다. 그리고 그림 6에는 각 레인의 정규화된 강도 프로필이 포함되어 있습니다.

분자량 축은 스크립트에 명시된 범위에 따라 세분화됩니다. 내보내기 데이터를 1로 설정하면 절대적분과 정규화된 적분 영역을 내보내세요. 대본을 실행하세요.

완료 후에는 지정된 분자량 범위 내에서 내보낸 절대 및 정규화 영역이 담긴 스프레드시트가 작업 폴더에 생성됩니다. 마지막으로, 7과 8자 문을 엽니다. 이 히스토그램은 각 레인별로 절대 및 정규화된 영역의 히스토그램을 각각 레인과 면적별로 그룹화합니다.

여기서 제시된 프로토콜은 플라즈마와 함께 배양된 나노입자 위에 형성된 단백질 코로나를 분리하고 특성화하기 위한 표준화되고 재현 가능한 워크플로우를 확립합니다. 이 방법은 각 개인화된 코로나의 생물학적으로 의미 있고 진단적으로 중요한 특징을 포착할 수 있는 매우 일관된 SDS 페이지 프로필을 제공합니다. 모든 조건에서 얻어진 SDS 페이지 프로필은 매우 재현성이 높았습니다.

플라즈마 농도를 5%에서 50%로 증가시키면서 SDS 페이지 프로필의 30에서 80킬로달톤 영역에서 신호 강도가 더 강해졌습니다. 자동 피펫팅 작업 흐름은 거의 동일한 전기영동 프로파일을 제공했습니다. 그래핀 산화물은 높은 표면적과 전하 특성 덕분에 잘 해상된 안정적인 코로나 프로파일을 지속적으로 생산했습니다.

소형, 중형, 대형 그래핀 산화물 샘플의 크기 분포는 좁고 겹치지 않으며 각각 100, 300, 750 나노미터 중심을 이루었습니다. 그래핀 산화물 위에 형성된 단백질 코로나의 SDS 페이지 프로필은 크기별로 유사했습니다. 희석 비율마다 뚜렷한 차이가 관찰되었으나, 혈장 농도가 낮을수록 특정 분자량 범위에서 더 강한 띠가 형성되어 선택적 단백질 농축이 이루어졌음을 나타냈다.

중간 플라즈마 희석 상태에서 밀도 측정 프로파일은 특히 PDAC 샘플이 신호 강도가 감소한 20에서 30킬로달톤 영역에서 질병 특이적 차이를 드러냈습니다. SDS 페이지 기반 프로파일링 모델만으로도 PDAC와 대조군 샘플 모두를 83%의 정확도와 균형 잡힌 민감도와 특이도로 정확히 식별했습니다. SDS 페이지 코로나 프로필과 CA 19에서 9 수준을 통합한 통합 진단 모델은 PDAC 환자 분류에서 가장 높은 정확도, 민감도, 특이성을 달성합니다.

우리는 자동화된 워크플로우, 비기술 기반 기법, AI 기반 도구를 활용하여 암 진단 연구를 발전시킵니다. 저희 프로토콜은 신속하고 사용자 친화적이며 WHO 규정을 준수하여 표준화된 재현 가능한 단백질 코로나 지문을 강력한 진단 관련성을 보장합니다.