아밀로이드와 교차 베타 구조

저희 연구는 X선 섬유 회절을 이용해 교차 베타 아밀로이드 섬유 구조와 그 분자 조직을 조사합니다. 이 프로토콜은 X선 섬유 회절을 사용하여 교차 베타 패턴을 확인하고 섬유 구조를 명확히 합니다. 이 프로토콜은 교차 베타 조직 확인부터 분자 세부 정보 규명에 이르기까지 아밀로이드 섬유의 구조 분석을 가능하게 합니다.

우선, 단백질이나 펩타이드 섬유를 정렬하여 이상적으로는 섬유 축이 모두 평행한 다발을 만듭니다. 촛대 왁스를 뜨거운 판으로 녹여 녹여서 액체가 될 때까지 하세요. 유리 절단기를 사용해 1밀리미터 붕규산 유리 모세관을 약 2-3센티미터 길이로 절단했습니다.

잘린 모세혈관을 잠시 액체 왁스에 담가. 그 다음 모세관 작용으로 촛불 왁스를 모세관 내 약 1-2밀리미터까지 끌어올립니다. 이제 플라스티신을 사용해 밀봉된 모세혈관을 페트리 접시 안에 수평으로 붙이세요.

모세혈관의 왁스로 채워진 끝 사이에 0.5-2밀리미터의 간격을 유지하세요. 피펫을 사용해 두 모세혈관의 왁스로 채워진 끝 사이에 10마이크로리터 크기의 섬유질 용액 방울을 조심스럽게 떠 놓으세요. 페트리 접시를 덮어 샘플을 먼지로부터 보호하고 하룻밤 동안 증발시키세요.

그 후 접시를 밀봉해 건조 환경을 유지하세요. 유리 모세혈관 내 아밀로이드 섬유를 정렬시키기 위해, 1밀리리터 주사기와 고무관을 0.7밀리미터 직경의 실리콘화 유리 모세혈관의 넓은 끝에 고정합니다. 모세혈관 안으로 2-3센티미터 정도의 섬유 현탁액을 흡입하세요.

모세관 한쪽 끝은 녹인 왁스로 밀봉하고, 다른 쪽 끝은 열어두어 증발을 허용하세요. 모세혈관을 수직으로 배치하고 건조된 디스크가 형성될 때까지 기다립니다. 섬유를 매트나 얇은 필름으로 정렬하려면, 고농도 섬유 샘플을 유리 슬라이드 위에 올려 덮고 24시간 동안 자연 건조합니다.

섬유 다발 스톡을 고니오미터 헤드에 조심스럽게 장착하고 X선 빔이 다발을 통과하도록 방향을 맞추세요. 섬유질 매트 샘플을 사용할 경우, X선 빔이 매트 가장자리를 통과하도록 방향을 맞추세요. 교차 편광기가 장착된 광학 현미경으로 샘플을 검사하여 이중 굴절을 관찰합니다.

샘플을 섬유 다발, 매트, 디스크 중 어떤 형태로 X선 빔 내에서 위치시키세요. 자체 제작된 X선 장비나 싱크로트론 방사선을 이용해 회절 패턴을 수집하세요. 데이터 분석을 수행하려면 파일을 CLEARER 회절 패턴 분석 소프트웨어에 업로드하세요.

회절 패턴과 회절 설정으로 이동하여 픽셀 크기, X선 광원, 시료와 검출기까지의 거리를 입력할 수 있습니다. 이미지 처리를 클릭하고 회전하여 회절 이미지를 회전시켜 자오선이 수직이 되도록 하세요. 중심 모듈을 사용해 회절 패턴으로 이동한 후 중심 이미지를 클릭해 이미지를 중앙에 맞추세요.

자오선과 적도축을 정의하세요. 중앙에 있는 이미지를 저장해 후 분석을 위해 보관하세요. 다음으로, 자오선과 적도를 따라 적절한 각도를 지정합니다.

회절 패턴을 클릭한 후 반경 평균 모듈을 클릭하여 회절 신호 위치를 나타내는 그래프를 생성합니다. 강렬함과 강렬함의 대립. 회절 패턴 메뉴에서 피크 파인드 모듈로 이동하여 회절 신호를 측정하고 자동으로 출력합니다.

피크 탐색 폭을 조정하여 잡음 없이 진짜 신호를 감지하세요. 피크 파인드를 이용해 회절 신호 위치 출력을 확인하려면 줌 및 측정 옵션을 사용하세요. 유닛 셀 최적화 모듈을 사용하여 잠재적 유닛셀 치수를 탐색하세요.

강한 적도 신호를 기반으로 초기 추정치를 입력하고 셀 탐색의 최소 및 최대 지수를 정의합니다. 잠재 단위 셀 치수를 계산하고 예측된 회절 신호 위치를 관측된 반사와 비교합니다. 데이터와 샘플에 가장 적합한 단위 셀을 선택하세요.

분자 모델을 구축하기 위해, 결정된 단위 세포에 맞는 베타 시트 구성으로 펩타이드의 3D 배열을 구축합니다. 대칭성 관련 부품이 모두 포함되는지 확인하세요. 다음으로 회절 시뮬레이션을 클릭한 뒤, 구조 및 구조 체인 생성기를 클릭한 후 PDB 모델을 불러오세요.

섬유 축과 빔 축을 할당하고, 단위 셀 치수를 입력한 후 입체 충돌을 확인하세요. 회절 시뮬레이션으로 이동하여 섬유 회절 시뮬레이션을 클릭하여 PDB 좌표를 섬유 회절 시뮬레이션 모듈에 업로드하세요. 광섬유 축 방향, 빔 방향, 단위 셀 치수, X선 광원 및 검출기 설정을 입력한 후 시뮬레이션을 실행하기 위해 '시뮬레이션'을 클릭하세요.

빔 축이 광섬유 축에 수직인지 확인하세요. 그 다음 파일로 이동해 '다른 이름으로 저장'을 클릭해 시뮬레이션 설정을 html 파일로 저장해 나중에 편집할 수 있게 하세요. 시뮬레이션된 회절 패턴을 RAW 형식이나 TIFF 파일로 저장하세요.

시뮬레이션된 패턴과 실험 회절 패턴을 비교해 보세요. 동일한 분석 워크플로우를 사용하여 시뮬레이션된 회절 신호를 측정합니다. 이 값들을 기록하고 실험 데이터와 비교하세요.

전자현미경 촬영에서는 X선 섬유 샘플 준비에 적합한 격자 위에 높은 밀도의 아밀로이드 섬유가 나타났습니다. 스트레치 프레임 정렬 섬유는 4.76 옹스트롬에서 자오선 반사와 사슬 길이, 시트 간격, 프로토필라멘트 크기에서 발생하는 적도 반사를 가진 특징적인 교차 베타 회절 패턴을 만들어냈습니다. 이상화된 교차 베타 회절 패턴은 자오선 및 적도 반사가 섬유 축을 따라 반복적인 간격에 대응함을 보여주었다.

중심이 잘 맞춰진 회절 패턴은 적도와 자오선 피크가 위치가 겹치는 대칭적이었다. 회절 피크는 피크 발견 분석을 통해 자동으로 검출되고 목록화되었습니다. 검출된 회절 피크는 그럴듯한 단위 셀 치수를 식별하는 데 사용되었다.

식별된 단위 셀을 사용하여 구조 모델을 작성하고 회절 시뮬레이션 전에 시각화했습니다. 제안된 구조 모델에서 생성된 시뮬레이션 회절 데이터는 반사 위치와 상대 강도 모두에서 실험 회절 패턴과 상당히 일치하는 모습을 보였다. 시뮬레이션 및 실험 회절 패턴을 겹치면 해당 반사의 정렬이 더욱 입증되었습니다.

적절한 시료 정렬은 회절 데이터의 품질과 그로부터 얻을 수 있는 정보를 결정하기 때문에 매우 중요합니다. 이 연구는 원자 해상도 구조 모델링과 AFM과 같은 다른 구조 기법과의 통합을 가능하게 하여 상세한 분자 구조를 구현할 수 있게 합니다.