Name: 시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 VCP/p97 매개 제거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 배우세요 Streptococcus pneumoniae의 유비퀴틴화 및 VCP/p97-UFD1-NPLOC4 복합체를 이용한 세균 용해 활성 분석 방법. 이 기법은 병원체 방어 메커니즘 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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<ol><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unravelling+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis%3A+from+the+lysosome+to+ubiquitin+and+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).</li>
<li>Damgaard, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%3A+from+cell+signalling+to+disease+biology+and+new+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities.</a> Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).</li>
<li>Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+logic+of+ubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly.</a> Front Physiol. 10, 835(2019).</li>
<li>Kikkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HRD1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+involved+in+degradation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).</li>
<li>Korac, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-independent+function+of+optineurin+in+autophagic+clearance+of+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).</li>
<li>Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+Streptococcus+pneumoniae+via+the+polymeric+immunoglobulin+receptor+of+epithelial+cells+relies+on+clathrin-+and+caveolin-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms.</a> Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).</li>
<li>Ercoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+replication+of+Streptococcus+pneumoniae+inside+splenic+macrophages+serves+as+a+reservoir+for+septicaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia.</a> Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).</li>
<li>Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+novel+surface+structure+encoded+by+Salmonella+pathogenicity+island+2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2.</a> EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).</li>
<li>Surve, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+pneumolysin+expression+governs+the+fate+of+Streptococcus+pneumoniae+during+blood-brain+barrier+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking.</a> PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).</li>
<li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+SMURF1+functions+in+selective+autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+anti-tuberculous+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense.</a> Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li>
<li>Manzanillo, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Parkin+mediates+resistance+to+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens.</a> Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).</li>
<li>Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+host+cell+ubiquitylation+machinery+targeting+cytosolic+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella.</a> EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).</li>
<li>Huett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LRR+and+RING+domain+protein+LRSAM1+is+an+E3+ligase+crucial+for+ubiquitin-dependent+autophagy+of+intracellular+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium.</a> Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).</li>
<li>Otten, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitylation+of+lipopolysaccharide+by+RNF213+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection.</a> Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).</li>
<li>Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBXO2%2FSCF+ubiquitin+ligase+complex+directs+xenophagy+through+recognizing+bacterial+surface+glycan%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan.</a> EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).</li>
<li>Apte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+innate+pathogen+sensing+strategy+involving+ubiquitination+of+bacterial+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins.</a> Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+AAA-ATPase+VCP%2Fp97+lyses+ubiquitinated+intracellular+bacteria+as+an+innate+antimicrobial+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence.</a> Nat Microbiol. , (2025).</li>
<li>Mitchell, G., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+to+intracellular+pathogens%3A+balancing+microbial+elimination+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation.</a> Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).</li>
<li>Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-+and+ATP-dependent+unfoldase+activity+of+p97%2FVCP-NPLoc4-UFD1L+is+enhanced+by+a+mutation+that+causes+multisystem+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).</li>
<li>Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+protein+expression+systems+and+PTM+landscape+in+the+study+of+transcription+factor+ELK-1%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1.</a> Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>50X 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>프로메가&nbsp;</td><td>G6521</td><td></td></tr><tr><td>6배-히스-유비퀴틴</td><td>UBPBio</td><td>E1100</td><td></td></tr><tr><td>A549 세포주 &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루어 488</td><td>인비트로젠</td><td>A21202&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루어 555</td><td>인비트로젠</td><td>A-31572 &nbsp; 그리고 nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>항유비퀴틴 항체</td><td>엔조</td><td>BML-PW8810-0100</td><td></td></tr><tr><td>항유비퀴틴 K48 특이적 클론 Apu2 항체</td><td>시그마 올드리치</td><td>ZRB2150</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마 올드리치</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/a6419">A6419</a></td><td></td></tr><tr><td>비</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>M210</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(고혈당)</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>AL251</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>깁코 (미국에서 기원)</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>PureSynth&nbsp;</td><td>PSR37325</td><td></td></tr><tr><td>젠장</td><td>시그마 올드리치</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마 올드리치</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>시그마 올드리치</td><td>TC006</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>시그마 올드리치</td><td>E6148</td><td></td></tr><tr><td>pET28a-p97 플라스미드</td><td>우리 연구실</td><td></td><td>플라스미드는 요청 시 제공 가능</td></tr><tr><td>pET41b-NPLOC4 플라스미드</td><td>우리 연구실</td><td></td><td>플라스미드는 요청 시 제공 가능</td></tr><tr><td>pET41b-UFD1 플라스미드</td><td>애드진</td><td>플라스미드 #117107</td><td></td></tr><tr><td>Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7&nbsp;</td><td>시그마 올드리치</td><td>23-030</td><td></td></tr><tr><td>폐렴구균 R6 균주</td><td>ATCC</td><td>ATCC BAA-255</td><td>위험군 -2 병원체, BSL-2 시설에서 다뤄야</td></tr><tr><td>토드 휴잇 육수 가루</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>M313</td><td></td></tr><tr><td>UBE1</td><td>UBPBio</td><td>B1100</td><td></td></tr><tr><td>UbE2C</td><td>UBPBio</td><td>C1300</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>MB032</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물 분말 & nbsp;</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>RM027</td><td></td></tr></tbody></table>

시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 vcp/p97 매개 제거

In-vitro Reconstitution of Bacterial Ubiquitination and VCP/p97-mediated Elimination

우리 프로토콜은 포유류 A549 세포를 이용해 유비퀴틴화 과정을 시작하는 데 필요한 구성 요소가 풍부한 세포 해해액을 생산하는 과정을 상세히 설명합니다(그림 1A). 이 용해액은 농축 상태이거나 UBE1(E1 유비퀴틴 활성화 효소), UbE2C(E2 유비퀴틴 결합 효소), Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 복합체(E3 유비퀴틴 리게아제)와 같은 정제 성분으로 대체되든, 정제된 유비퀴틴 및 ATP와 혼합되어 박테 리아의 시험관 내 유비퀴틴화를 촉진합니다(그림 1B)). 유비퀴틴화 후 박테리오리오리티 반응을 평가하기 위해, 정제된 VCP/p97과 그 보조인자 UFD1, NPLOC4를 반응에 포함시켰습니다(그림 1C).
<p class="jove_content" fo:keep-together...

시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 VCP/p97 매개 제거

Ubiquitination is a versatile post-translational modification that plays a critical role in cytosolic immunity. Upon invasion of the host cells, ...

in-vitro-reconstitution-bacterial-ubiquitination-vcpp97-mediated

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.

외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

이 작품은 탈리도마이드 유사체의 표적인 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론(CRBN)의 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 새로운 접근법으로서 포말리도마이드 계, 이중 기능적 호모-PROTAC의 합성 및 특성화를 설명한다.

포말리도마이드 기반 호모-PROTACs에 의한 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론의 화학적 불활성화

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

본 연구는 E3 유비퀴틴 리구아제 촉매 활성의 분석을 위한 체외 유비쿼터스 분석 프로토콜에 대한 상세한 제공. 재조합 단백질은 대장균 배양과 같은 원핵계를 사용하여 발현되었다.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

유비퀴티뉴션은 번역 후 중요한 단백질이며, 이의 난독증은 수많은 인간 질환에 연루되어 있다. 이 프로토콜은 파지 디스플레이가 유비퀴티니션의 특이성, 효율성 및 패턴을 제어하는 E3 리개아의 활성을 결합하고 조절할 수 있는 새로운 유비퀴틴 변종을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.

파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

프로토콜은 p53 종양 억제 단백질을 예로 사용하여 포유류 세포로부터 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 단계별 방법을 설명합니다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제하였다.

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

이 프로토콜은 재조합 단백질 정제와 유비퀴틴 사슬 절단 분석을 결합하여 신경 발달 장애와 관련된 유전적 변이가 탈유비퀴틸화 효소 활성에 미치는 영향을 측정하는 방법을 설명합니다.

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

배우세요 Streptococcus pneumoniae의 유비퀴틴화 및 VCP/p97-UFD1-NPLOC4 복합체를 이용한 세균 용해 활성 분석 방법. 이 기법은 병원체 방어 메커니즘 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 VCP/p97 매개 제거

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