시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 VCP/p97 매개 제거
2026년 1월 2일
이 프로토콜은 포유류 세포 용해액 또는 순수 유비퀴틴 효소 복합체를 이용해 폐렴 구균을 유비퀴틴화하는 방법을 설명하며, 이후 정제된 VCP/p97-UFD1-NPLOC4 단백질 복합체로 처리하여 박테리오리네이션 활성을 평가하여 유비퀴틴 의존성 면역 효과 연구를 가능하게 합니다.
저희 연구는 VCP 또는 p97이 여러 병원체에 대해 세포질 방어자로서 어떻게 작용하는지 밝혀냅니다. 이로 인해 VCP 또는 p97의 치료 응용 및 생명공학 전략 잠재력이 열립니다. 일상적인 생화학 외에도, 초해상도 현미경, 크라이오 EM, 크라이오 ET를 이용해 이 숙주 효과체가 병원체에 어떻게 조직되어 파괴하는지 규명합니다.
우선, 연쇄상구균 폐렴을 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소를 토드 휴잇 효모 배지에서 하룻밤 동안 재배하세요. 하룻밤 배양액의 일부를 신선한 토드 휴잇 효모 배지 10부에 접종하고, 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 600나노미터에서 광학 밀도가 0.4에 도달할 때까지 배양합니다. 그 다음 연쇄상구균 폐렴 배양 900마이크로리터와 50% 글리세롤 600마이크로리터를 섞어 영하 80도에서 저장합니다.
그 후 신선한 연쇄상구균 폐렴 육수를 영하 80도에서 해동하고, 토드 휴잇 효모 배지 5밀리리터에 완전히 접종합니다. 약 10의 연쇄상구균 폐렴 세포의 7제곱을 취하세요. 세포를 완전히 세척하려면 박테리아를 반응 완충제에 다시 넣고 21,000g 원심분리기를 실온에서 5분간 보관합니다.
549 포유류 세포 용해액으로 펠릿을 다시 현탁하세요. 그 다음 정제된 유비퀴틴과 1밀리몰라 아데노신 삼인산을 추가하고 27도 섭씨에서 1시간에서 2시간 배양합니다. 그 후 1몰 요소가 포함된 반응 버퍼로 박테리아를 한 번 세척한 뒤, 반응 버퍼만 넣은 채로 두 번 더 세척합니다.
박테리아를 1% 파라포름알데히드로 고정하세요. 고정 후에는 1밀리그램당 글리신 1밀리그램을 포함한 PBS로 세포를 15분간 배양합니다. 그 다음 PBS로 두 번 세척하세요.
반응 버퍼 내 유비퀴틴과 다른 필요한 성분을 결합하여 반응 혼합물을 준비합니다. 반응 혼합물의 총 부피를 100에서 150 마이크로리터로 조절합니다. 박테리아를 유비퀴틴 효소 반응 혼합물에 다시 현탁시키고, 27도 섭씨에서 2시간 동안 배양합니다.
박테리아를 요소 포함 반응 완충제로 세 번 세척한 후 1% 파라포름알데히드로 고정합니다. 고정 후에는 1밀리그램당 글리신 1밀리그램을 포함한 PBS로 세포를 15분간 배양합니다. 그 후 샘플을 3% BSA에 27도 섭씨에서 1시간 배양하고, PBS로 두 번 세척합니다.
유비퀴틴화된 박테리아를 일반적으로 면역형광 분석법에서 사용하는 농도보다 높은 농도로 1차 항체 용액에 재현탁합니다. 그 후 27도 섭씨에서 1시간 동안 배양하세요. 박테리아를 PBS로 두 번 세척한 후, Alexa Fluor 488과 Alexa Fluor 555와 결합된 해당 2차 항체에 다시 현탁합니다.
이제 라벨이 붙은 박테리아 샘플 약 10에서 20마이크로리터를 유리 슬라이드 위에 드롭캐스팅하고, DAPI 유무 중 5에서 10마이크로리터의 마운팅 매체를 혼합합니다. 샘플 위에 덮개를 덮고 휴지로 과도한 액체를 닦아내세요. VCP p97 6개와 1개의 NPLOC4 1개, UFD-1 1개를 결합합니다.
반응 혼합물의 부피를 약 90마이크로리터로 조절하고, 반응 완충제를 사용해 얼음 위에 2시간 배양합니다. 다음으로, p97 UFD-1, NPLOC4가 포함된 반응 혼합물에 1에서 2밀리몰라 아데노신 삼인산을 첨가합니다. 그 다음 10의 유비퀴틴화된 연쇄상구균 폐막세포 7의 제곱과 결합하여 37도에서 2시간 배양합니다.
처리 직후 반응 혼합물에서 10마이크로리터 알리코트를 추출해 연속 희석을 수행합니다. 뇌 심장 주입 오거 플레이트에 희석액을 10에서 20마이크로리터씩 스포핑하세요. 제로 아워와 두 시간 사이의 식민지 형성 단위를 평가하세요.
박테리아 생존 비율은 2시간 CFU 수치를 0시간 CFU 수로 나누고 100을 곱하여 계산합니다. 포유류 세포 용해액 또는 재구성된 E-1, E-2, E-3 효소 시스템으로 처리했을 때 폐렴구균의 유의미한 유비퀴틴화가 관찰되었습니다. 대조군에서는 유비퀴틴화 신호가 없었고, 유비퀴틴화된 연쇄상구균 폐렴이 OTUB1에 노출되었을 때 유비퀴틴 신호가 현저히 감소하여 K48 연관 폴리 유비퀴틴 변형을 확인하였다.
선 프로파일 분석 결과, 유비퀴틴과 박테리아 신호 사이에 완전한 중첩이 있어 공간적 공동 위치가 확인되었습니다. 3차원 재구성은 유비퀴틴과 폐렴구균 신호의 공간적 중첩을 확인했다. 야생형 p97은 그 보조인자인 UFD1과 NPLOC4와 결합했을 때, 세포 용해액이든 정제 효소 시스템을 사용하든 유비퀴틴화를 수행했든 2시간 후 세균 생존율을 10%에서 20%로 감소시켰습니다.
유비퀴틴화를 생략하거나 p97을 열로 비활성화했을 때, 또는 촉매적으로 비활성화된 p97 E57 8Q 돌연변이를 사용할 때도 박테리아 생존 능력 감소가 관찰되지 않아, 유비퀴틴화와 활성 p97 모두 박테리아 사살에 필수적임을 확인했습니다. 우리 연구는 숙주 E3 유비퀴틴 리아제가 다양한 병원체를 변형하고 감염 위협을 제거하는 효과기 메커니즘을 조사하는 방식을 밝혀줍니다. 다음으로는 p97 또는 VCP가 어떻게 조절되는지 탐구하고, 항균 활성을 높이기 위해 더 발전시키는 작업을 목표로 합니다.
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개요
이 프로토콜은 포유류 세포 용해물 또는 순수한 유비퀴틴 효소 복합체를 사용하여 Streptococcus pneumoniae를 유비퀴틴화하는 방법을 설명합니다. 연구는 정제된 VCP/p97-UFD1-NPL0C4 단백질 복합체의 박테리오리틱 활성을 평가하여 병원체에 대한 세포질 방어자로서의 역할을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 미생물학
- 면역학
배경
- VCP/p97은 세포 방어 메커니즘에서 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다.
- 병원체와의 상호작용을 이해하면 치료 전략에 도움이 될 수 있습니다.
- 연구는 이러한 상호작용을 분석하기 위해 고급 이미징 기술을 활용합니다.
- 유비퀴틴화는 면역 반응 조절의 핵심 과정입니다.
연구 목적
- Streptococcus pneumoniae에 대한 면역 반응에서 VCP/p97의 역할을 조사합니다.
- 병원체 방어에서 VCP/p97의 치료 가능성을 탐구합니다.
- 유비퀴틴 의존적 면역 유도체를 연구하는 방법을 개발합니다.
사용된 방법
- 포유류 세포 용해물을 사용하여 Streptococcus pneumoniae의 유비퀴틴화.
- 정제된 VCP/p97-UFD1-NPL0C4 단백질 복합체의 적용.
- 상세 이미징을 위한 초고해상도 현미경.
- 구조 분석을 위한 동결 전자 현미경 및 동결 전자 단층 촬영.
주요 결과
- VCP/p97 복합체의 박테리오리틱 활성을 입증했습니다.
- 병원체에 대한 숙주 유도체의 구성에 대한 통찰력을 제공했습니다.
- 미래 치료 응용에 대한 기반을 제공했습니다.
- 면역 반응에서 유비퀴틴화의 중요성을 강조했습니다.
결론
- VCP/p97은 병원체에 대한 면역 방어에서 중요한 구성 요소로 작용합니다.
- 연구는 VCP/p97을 타겟으로 하는 생물 공학 전략의 방향을 제시합니다.
- 그 메커니즘과 응용을 완전히 이해하려면 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Dissecting bacterial ubiquitination and VCP/p97-mediated elimination in a cell-free system enables mechanistic de-risking of host-pathogen interactions at the earliest stages of discovery. This approach clarifies the functional contribution of immunity-linked ubiquitin ligases and effectors, supporting predictive confidence in target validation and pathway prioritization. The method provides a reusable platform for interrogating cytosolic immunity and effector mechanisms relevant to anti-infective portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of host E3 ligase and effector function in bacterial clearance.
- Supports mechanistic de-risking by isolating individual pathway contributions in vitro.
- Facilitates functional target validation for cytosolic immunity effectors such as VCP/p97.
- Provides quantitative viability outputs for hypothesis-driven triage.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated, cell-free system for reproducible ubiquitination and effector testing.
- Delivers quantitative colony-forming unit (CFU) readouts for assay standardization.
- Enables scalable screening of effector variants or inhibitors in a controlled context.
- Supports platform reuse for diverse bacterial targets and effector combinations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant bacterial models such as Streptococcus pneumoniae.
- Provides continuity from molecular discovery to preclinical validation of immune effectors.
- Informs risk-adjusted advancement of anti-infective strategies targeting ubiquitin pathways.
- Supports translational biomarker development by linking ubiquitination status to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This in vitro reconstitution method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative assessment of bacterial elimination mechanisms.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for effector requirement and pathway specificity in bacterial clearance.
- Screening: Provides reproducible, quantitative CFU measurements for comparing effector activity and assay conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of viability reduction and ubiquitination status across experimental arms.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease-relevant bacterial models for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, cell-free platform adaptable to multiple pathogens and effector systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in cytosolic immunity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for effector and pathway interrogation.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of anti-infective targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program learning for host-pathogen interaction strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biochemistry, bacterial culture, and quantitative viability assays.
- Demands access to purified ubiquitin enzyme complexes, VCP/p97 effectors, and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions and analytical endpoints.
- Adaptable to different bacterial strains and effector variants with protocol optimization.
- Limited to cell-free mechanistic interrogation; does not capture full cellular context or in vivo complexity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:38
Setting Bacterial Culture for Ubiquitination Assay
1:42
In Vitro Ubiquitination Assay from Mammalian Lysate
2:45
In Vitro Ubiquitination Assay and Visualization of Ubiquitinated Bacteria
4:36
In Vitro Bacterial Killing Assay
5:54
Results
7:24
Conclusion
