바이오마커 발견에서 표적되지 않은 눈물액 지피도믹스를 위한 페놀 레드 실 샘플링 절차
December 12th, 2025
이 프로토콜은 페놀 레드 스레드와 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 기반 워크플로우를 사용하여 인간 눈물액 샘플을 수집하는 독특한 임상 프로토콜을 설명하여 눈물 지질 프로필을 발견합니다. 간단한 메틸 테르-부틸 에터(MTBE)/메탄올 이상 분리법은 눈물 바이오마커 발견을 위한 높은 회수율로 빠른 눈물 지질 추출을 가능하게 합니다.
우리는 향후 눈물 바이오마커 발견을 위해 재현 가능한 눈물 지질 프로필을 달성하기 위해 보다 표준화되고 조작이 쉬운 페놀 레드 실 기반 방법을 확립했습니다. 현재의 과제는 쉬르머 검사가 자극을 제거하는 반면, 모세혈관은 조작자마다 눈물 수집에 변동성을 보인다는 점입니다. 이로 인해 실험 보고성과 연구 간 비교가 어려워집니다.
우선, 장갑을 착용하고 작업대를 철저히 소독하여 샘플 오염을 방지하세요. 페놀 레드 실을 굽힌 바늘 반대편 끝을 잡고, 구부러진 후크 부분에 닿지 않도록 주의하세요. 대상에게 시선을 윗비강 방향으로 돌리라고 요청하세요.
그 다음 피험자의 아른 눈꺼풀을 부드럽게 내리고, 구부린 갈고리가 있는 페놀 레드 실을 눈 바깥쪽 가장자리 근처 측두두엽 결막에 삽입합니다. 이제 피험자에게 눈을 부드럽게 감고 머리를 약간 앞으로 기울여 페놀 붉은 실이 얼굴 피부에 닿지 않도록 하세요. 피험자의 아랫눈꺼풀을 다시 내리고, 샘플 부위와의 접촉을 피하며 페놀 레드 실을 부드럽게 제거하세요.
샘플링된 붉은 영역의 길이를 기록하세요. 멸균 겸자를 사용해 PRT를 새 샘플 튜브로 옮겨. 이제 샘플 튜브에 라벨을 붙이고 뚜껑을 제대로 덮으세요.
샘플 길이가 50밀리미터 미만이라면, 피험자에게 1분에서 3분간 휴식을 취한 후 같은 눈으로 눈물액 채취를 반복하세요. 새로 샘플링한 PRT를 별도의 샘플 튜브에 넣으세요. 메탄올과 깨끗한 종이 물티슈를 사용해 장갑과 겸자를 철저히 청소하여 찢어진 잔여물이나 오염물을 제거하세요.
그 후 완전히 자연 건조시키세요. 모든 샘플 튜브를 파라필름으로 밀봉하고, 임시 보관은 영하 20도, 장기 보관은 영하 80도에 즉시 보관하세요. 페놀 레드 실을 가공하기 전에 미세 가위와 겸자를 메탄올로 미리 세척하세요.
각 페놀 붉은 실에서 약 처음 3밀리미터 정도 구부러진 후크 끝을 잘라내세요. 샘플 영역을 페놀 레드 염료 전면까지 2밀리미터 조각으로 잘라내고, 깨끗한 1.5밀리리터 유기 용매 내성 마이크로 원심분리관으로 이 구간들을 수집합니다. 구부러진 후크 끝과 원하지 않는 PRT 부위는 버려.
추출 전에 샘플을 얼음 위에 올려 낮은 온도를 유지하세요. 이제 각 샘플에 얼음 차가운 질량분석법 등급 메탄올 232마이크로리터를 추가하고, 15초간 소용돌이를 통해 완전히 혼합합니다. 샘플을 미리 냉각된 초음파 세척기에서 15분간 초음파 세척하세요.
그 다음 각 샘플에 HPLC 등급의 메틸 테르-부틸 에테르 774마이크로리터와 탈이온수 194마이크로리터를 첨가합니다. 용매를 완전히 섞기 위해 다시 15초간 소용돌이를 사용하세요. 샘플을 다시 15분 더 냉각된 초음파 세척기에서 초음파 처리하세요.
초음파 검사 후, 샘플을 4도 섭씨로 설정한 ThermoMixer에서 분당 1,200 회전으로 8시간 동안 진동시키세요. 그 후 혼합물을 실온에 10분간 방치시킵니다. 혼합물을 10,000G에서 4도에서 10분간 원심분리합니다.
원심분리 후에는 혼합물이 두 개의 뚜렷한 액체 상으로 눈에 띄게 분리되어 있는지 확인하세요. 지질이 포함된 상층 유기상 700마이크로리터를 조심스럽게 수집하여 미리 냉각된 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 잔류 메틸 테르-부틸 에테르와 메탄올이 유해 화학 폐기물로 남아 있는 하부 수상은 폐기됩니다.
지질 추출물을 4도 섭씨로 설정한 냉장 SpeedVac 농축기를 사용해 4시간 건조하세요. 그 후 건조된 지질 추출물을 단기 보관은 영하 20도, 장기 보관은 영하 80도에 보관합니다. 메탄올과 클로로포름을 1:1 부피 비율로 혼합하여 메탄올-클로로포름 용매 혼합물을 준비합니다.
얼음처럼 차가운 메탄올-클로로포름 용매 혼합물 50마이크로리터를 사용해 건조된 지질 추출물을 재구성합니다. 재구성된 용액을 미리 냉각된 초음파 세척기에 15분간 소닉메이팅하세요. 이제 재구성된 지질 추출물을 14,000G, 4도 섭씨에서 10분간 원심분리합니다.
생성된 상청원 40마이크로리터를 유리 인서트가 장착된 오토샘플러 유리 바이알에 조심스럽게 옮깁니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석(LNM) 질량분석법 분석을 준비하기 위해 비슬릿 비중격 개방 캡으로 바이알을 단단히 밀봉하세요. 엄격한 기준을 적용하여, 복제 1, 복제 2, 복제 3 샘플 그룹에서 각각 773, 890, 1,025개의 고유 지질 종이 확인되었습니다.
양성 이온 모드는 26% 등급 A, 13.2% 등급 B, 60.8% 등급 C 등급을 가진 1,302종의 지질을 확인했습니다. 음이온 모드는 약 8.2% 등급 A, 22.9% 등급 B, 68.9% 등급 C를 가진 257종의 지질을 확인했습니다. 저장 관련 변이에도 불구하고, 세 샘플 세트 모두에서 394종의 고유한 지질 종이 일관되게 확인되었습니다.
세 차례 방문 간 피험자 간 변동 계수는 양성 모드에서 21.5%, 음수 모드에서 31.3%였습니다. 이 프로토콜은 재현 가능한 찢어진 지질도미 분석을 위한 표준화된 워크플로우의 부재를 해결하며, 연구 간 비교 가능성을 높일 수 있습니다. 저희 PRT 기반 방법은 자극을 최소화하고 빠른 눈물 수집을 가능하게 하며 수술자의 변동성을 줄입니다.
향후 연구는 대규모 집단에서 눈물 지질성 바이오마커를 검증하고, 개인화된 진단을 위한 다중체학을 통합할 것입니다.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
개요
이 프로토콜은 페놀 레드 스레드를 사용하여 눈물 액체 샘플을 수집하는 표준화된 방법을 설명하고 있으며, 이는 눈물 지질체학 연구에서 재현성을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 워크플로에는 지질 추출 및 분석을 위한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석기(LC-MS/MS)가 포함되어 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 임상 연구
배경
- 현재의 눈물 수집 방법은 종종 자극이나 변동성을 초래합니다.
- 표준화는 신뢰할 수 있는 바이오마커 발견에 중요합니다.
- 페놀 레드 스레드는 눈물 샘플링을 위한 덜 침습적인 대안을 제공합니다.
- LC-MS/MS는 지질체학 분석을 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.
연구 목적
- 눈물 지질체학 프로파일링을 위한 재현 가능한 방법을 확립합니다.
- 연산자의 변동성을 최소화하고 연구 간 비교 가능성을 향상시킵니다.
- 눈물 지질 바이오마커에 대한 향후 연구를 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 페놀 레드 스레드를 사용한 눈물 샘플 수집.
- 이상 분리 방법을 사용한 지질 추출.
- LC-MS/MS를 통한 지질 종류 분석.
- 안정성을 위한 제어된 온도에서의 샘플 저장.
주요 결과
- 양성 이온 모드에서 1,300개 이상의 지질 종류 식별.
- 샘플 간 394개의 고유 지질 종류의 일관된 식별.
- 양성 모드에서 21.5%의 주체 간 변동성 측정.
- 방법은 지질체학 연구의 재현성과 비교 가능성을 향상시킵니다.
결론
- 페놀 레드 스레드 방법은 자극과 변동성을 감소시킵니다.
- 표준화된 워크플로는 눈물 지질체학 분석의 신뢰성을 향상시킵니다.
- 향후 연구는 더 큰 코호트에서 지질 바이오마커를 검증하는 데 초점을 맞출 것입니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
