2025년 11월 14일
이 프로토콜은 리소좀 막 무결성 및 산성화의 변화를 감지하는 형광 프로브를 활용하여 괴사증 동안 리소좀 막 투과성을 모니터링하기 위한 살아있는 세포 이미징 방법을 설명합니다.
이 프로토콜은 형광 프로브를 이용해 괴사 중 리소좀 막 투과화를 모니터링하는 생세포 영상 방법을 설명합니다. 이 프로브는 소소좀 막의 완전성과 산성화 변화를 감지합니다. 이 분야의 과제는 세포 사사 과정에서 손상된 소기관의 역학을 특성화하고, 이 손상이 세포 소멸을 어떻게 촉진하거나 기여하는지 정확히 정의하는 것입니다. 우선, 항생제 보충제 DMEM 배지 2밀리리터에 5,000개의 세포를 무균 유리 바닥 접시에 플레이트링합니다.
접시를 37도에 맞춘 인큐베이터에 넣고 5% 이산화탄소를 넣고 하룻밤 동안 배양하세요. 덱스트란 그린 비즈 20마이크로리터를 신선한 항생제 보충 DMEM 배지에 25마이크로그램/밀리리터에 첨가하여 희석합니다. 기존 미디엄을 접시에서 제거하고, 소고기가 포함된 보충제 DMEM 매체 2밀리리터로 교체하세요.
접시를 37도에 맞춘 인큐베이터에 5% 이산화탄소를 넣고 24시간 배양하여 구슬이 리소좀으로 내화할 수 있도록 합니다. 이제 2밀리리터의 신선한 DMEM 배지에 1밀리몰라 라이소트래커 스톡 용액 2마이크로리터를 첨가합니다. 기존 매체를 이 염색 용액으로 교체하세요.
세포를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 2시간 배양합니다. 공초점 시스템 부품은 개인용 컴퓨터, 현미경, 스캐너 전원, 레이저 출력, 레이저 방출, 라이카 전원을 켜면 됩니다. 온도 조절기인 큐브와 이산화탄소 가스 믹서 컨트롤러인 브릭을 포함한 환경 제어장치를 켜세요.
이산화탄소와 산소 공급을 열어. 온도 조절기를 37도로 설정하세요. 가스 및 습도 조절기를 이산화탄소 5%, 습도 95%로 설정하세요.
영상 챔버를 조립해. 염색 후에는 세포를 2밀리리터 PBS로 세 번 세척한 후 신선하게 보충된 DMEM 배지 2밀리리터를 추가합니다. 이미징 전에 대물렌즈에 침수 오일을 바르세요.
접시를 현미경 스테이지에 장착하세요. 레이저 세기를 최대 3%(최대 5%)까지 조절한 후 현미경 소프트웨어에서 검출기 이득을 조정하여 신호를 최적화합니다. 대비 바를 조정해 배경을 최소화하세요.
대조 조건으로 사용되는 미처리 세포의 기초 이미지를 획득합니다. 플레이트를 층류 후드로 다시 넣고 1밀리리터 항생제 DMEM과 세포사멸 유도제를 추가하세요. 획득 소프트웨어에서 모드를 XYT로 설정하고, 512x512로 포맷하며, 속도는 400으로 하고, 줌은 3으로, 라인 평균은 1, 라인 누적은 3, 프레임 누적은 1, 시간 간격은 3분, 지속 시간은 8시간, 자동 초점을 활성화하세요.
타임랩스 수집을 시작하려면 시작을 클릭하세요. 초기 영상 검사에서 LysoTracker와 형광 표지된 덱스트란의 안정된 지점이 확인되어 치료 전 소소좀이 온전함을 나타냅니다. TSZ 치료 4시간 후 LyoTracker의 형광이 눈에 띄게 감소한 반면, 덱스트란은 확산된 세포질 분포를 나타내기 시작하여 초기 리소좀 막 투과성을 나타냈다.
치료 후 8시간이 지나면 LysoTracker의 신호는 거의 완전히 사라졌고, 많은 세포는 확산된 녹색 세포질 신호를 가진 녹색 덱스트란 지점을 유지했습니다. 우리는 리소좀 막 투과작용이 네크토토틱 유도 중인 생세포에서 직접 관찰할 수 있음을 입증했습니다. 이 프로토콜은 LysoTracker와 덱스트란 구슬의 조합이 라이소좀 pH와 화물 방출을 실시간으로 동시에 모니터링할 수 있음을 입증합니다.
이 생세포 영상 프로토콜의 발전에 중요한 점은 작은 pH 변화와 리소좀 막 투과를 실시간으로 모니터링할 수 있다는 점으로, 유세포분석이나 단층 염색과 같은 최종 분석에서 놓치는 동적 이벤트를 포착할 수 있습니다.
이 프로토콜은 괴사성 프로그램된 세포사(necroptosis) 중 리소좀 막 투과성 변화를 모니터링하기 위한 생체 세포 이미징 방법을 설명합니다. 리소좀 막 손상과 산성화 변화를 감지하기 위해 형광 프로브를 사용합니다.
Real-time live-cell imaging of lysosomal membrane permeabilization (LMP) during necroptosis addresses a critical gap in understanding regulated cell death mechanisms relevant to target validation and mechanistic de-risking. This approach enables precise temporal mapping of organelle dysfunction, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Integrating dynamic LMP monitoring informs portfolio decisions by clarifying cell death pathways and potential intervention points.
This live-cell imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling dynamic assessment of organelle integrity and cell death progression.