Name: 괴사증 중 리소좀 막 투과화의 살아있는 세포 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: 학습하세요 괴사증 중 리소좀 막 투과화를 실시간으로 모니터링하는 살아있는 세포 이미징 방법을. 형광 프로브를 활용하여 리소좀 산성도와 막 완전성 변화를 동시에 관찰할 수 있습니다.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>HT-29 셀</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>대장암 세포</td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>맷텍 코퍼레이션</td><td>P35G-1.5-14-C-GRD</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL</td><td></td></tr><tr><td>공초점 현미경</td><td>라이카</td><td>SP8WLL</td><td></td></tr><tr><td>덱턴 그린 비즈</td><td>서모피셔</td><td>D1820</td><td>덱스트란, 플루오레세인, 10,000 MW, 음이온, 라이신 고정 가능</td></tr><tr><td>둘벡코의 변형 독수리 미디엄(DMEM)</td><td>코닝&nbsp;</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>시티바와 nbsp;</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>라이소트래커 레드 DND-99</td><td>인비트로젠</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>오일 침수형 HF</td><td>전자현미경 과학</td><td>16915-01</td><td></td></tr><tr><td>페니실린과 스트렙토마이신 (P/S)&nbsp;</td><td>시그마-올드리치</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>코닝</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>스맥 모방 (S)</td><td>BV6, ApexBio, 카탈로그</td><td>B4653</td><td>최종 농도, 1 mM</td></tr><tr><td>브릭앤앤비스핀;</td><td>생명 영상 서비스</td><td>13685</td><td>가스 믹서 CO2 컨트롤러</td></tr><tr><td>큐브</td><td>생명 영상 서비스</td><td>CBO2A</td><td>온도 제어 챔버 현미경</td></tr><tr><td>종양 괴사 인자 알파 (TNF-&α; - T)</td><td>페프로텍</td><td>30001A100UG</td><td>최종 농도, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>z-VAD-FMK (Z)</td><td>에이펙스바이오</td><td>A1902</td><td>최종 농도, 20 mM</td></tr></tbody></table>

괴사증 중 리소좀 막 투과화의 살아있는 세포 이미징

Live-cell Imaging of Lysosomal Membrane Permeabilization During Necroptosis

이 프로토콜에 설명된 절차를 통해 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포 이미지를 획득하여 LMP를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 그림 1 은 세포 도금에서 이미지 획득에 이르기까지 실험 프로토콜의 개략도를 보여줍니다. 0일째, 5,000개의 HT-29 세포를 도금하고 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양했습니다. 24시간(1일) 후, 세포를 동일한 조건에서 추가로 24시간 동안 플루오레세인 표지 덱스트란 비드(25μg/mL)와 함께 배양했습니다. 이 구슬은 엔도사이토시스와 리소좀으로의 이동에 의해 내면화되며, 그곳에서 축적되어 밝은 점점으로 나타납니다. 2일차(실험일)에 세포를 37°C 및 5%CO2에서 2시간 동안 pH에 민감한 LysoTracker 염료(1μM)로 처리했습니다. LysoTracker는 후기 엔도좀 및 리소좀과 같은 산성 구획 내에서 강한 형광을 집중하고 나타냅니다. 이미징 30분 전에 프로토콜의 4단계에 설명된 대로 온도, 가스 및 습도 컨트롤러를 포함하여 공초점 현미경 시스템의 전원을 켜고 안정화했습니다. 그림 2와 같이 이미징 챔버가 조립되었습니다. 488nm(녹색) 및 555nm(빨간색) 레이저를 사용했습니다.
LysoTracker와 배양한 후, 세포를 PBS로 3회 조심스럽게 세척하고, 10% FBS 및 1% P/S를 보충한 신선한 DMEM 2mL를 첨가하였다. 플레이트를 현미경으로 옮기고 63x/1.40 NA 오일 침지 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 도포했습니다. 그런 다음 5.5단계에서 설명한 대로 이미징 조건을 최적화하기 위해 레이저 강도 및 배경 수준을 조정했습니다. 프로토콜의. 우리의 초기 이미지는 Lysotracker 및 플루오레세인 표지 덱스트란의 안정적인 누점의 존재를 확인했으며, 이는 온전한 리소좀을 나타냅니다(그림 3). 기준선 이미지는 T/S/Z 이전에 획득되어 대조군으로 사용되었습니다. 차량은 적용되지 않았습니다.
초기 이미징 및 현미경 설정을 설정한 후 플레이트를 층류 후드로 되돌리고 100ng/mL TNF-α(T), 500nM SMAC 모방체(S) 및 100μM Z-VAD-FMK(Z)를 포함하는 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 DMEM 1mL를 첨가했습니다. 이미징은 프로토콜의 6단계에서 설명된 이미징 획득 매개변수를 사용하여 컨포칼 현미경에서 계속되었습니다. 그림 3, 보충 동영상 S1 및 보충 동영상 S2에서 볼 수 있듯이, T/S/Z 처리된 세포에서 LysoTracker 형광의 점진적인 감소는 리소좀 변화의 초기 지표로 작용했습니다. 이 손실은 리소좀에서 사이토솔로의 플루오레세인 표지 덱스트란의 유출(점상에서 확산 이동)으로 뒤따랐으며 때때로 동시에 발생하여 LMP를 나타냅니다. 8시간에서 거의 모든 리소트래커 신호가 사라졌지만, 많은 세포는 여전히 세포질 녹색 신호와 함께 녹색 점점을 유지했으며, 이는 리소좀 pH 구배의 손실이 완전한 LMP 및 화물 방출에 선행함을 시사합니다.
<img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="그림 1"> 
그림 1: 실험 프로토콜의 개략도. (BioRender.com 년에 작성) 초기에 5,000개의 세포를 도금하고(0시간) 24시간 동안 배양했습니다. 그 후, 덱스트란 비드(25μg/mL)를 첨가하고 추가로 24시간 동안 배양했습니다. 48시간에 LysoTracker(1μM)를 첨가하고 2시간 동안 배양했습니다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후(1단계) 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 신선한 DMEM 2mL를 첨가하였다(2단계). 현미경 설정을 조정하고(3단계), 세포를 TNF-α(T), SMAC 모방체(S) 및 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMZ(Z)(4단계)로 처리한 후 살아있는 세포 이미지 획득(5단계)을 수행했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="그림 2"> 
그림 2: 이미징 챔버 설정 다이어그램. (A) 샘플 홀더, (B) 가스 배양 챔버 및 (C) 상단 뚜껑. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="그림 3"> 
그림 3: T/S/Z 처리 전후의 HT29 세포의 대표 이미지. 세포를 Lysotracker 빨간색 및 덱스트란 녹색 비드로 염색하고 TNF-α(T), SMAC 모방체(S) 및 판-카스파제 억제제 Z-VAD-FMZ(Z)로 처리했습니다. 스케일 바: 10μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 동영상 S1: 덱스트란 녹색 비드와 함께 배양하고 T/S/Z로 처리한 HT29 세포의 타임랩스. 세포 반응을 평가하기 위해 세포를 6시간 이상 모니터링했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S1_Dextran%20Green%20Beads.mp4" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 동영상 S2: LysoTracker red와 함께 배양하고 T/S/Z로 처리한 HT29 세포의 타임랩스. 세포 반응을 평가하기 위해 세포를 6시간 이상 모니터링했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S2_LysoTracker%20red.mp4" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Necroptosis, a form of regulated necrosis, culminates in cell membrane rupture. Our lab and others have discovered that lysosomal membrane ...

live-cell-imaging-lysosomal-membrane-permeabilization-during

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를...

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

친 유성 염료 FM1-43에 노출 된 세포의 라이브 영상은 기공 형성 독소는 세포막에서 제거되는 반응 속도의 정밀한 결정을 허용한다. 이것은 CA에 대한 요구 사항이 +, sphingomyelinase 및 세포막 수리 및 다른 인자를 평가하는 데 사용될 수있는 민감한 분석이다.

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup&gt; 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에&gt;와 Sphingomyelinase

치유 손상균의 처리는 세포막 손상의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 포함한다. 이 프로토콜은 이러한 프로세스를 모니터링하는 분석을 설명합니다.

이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

우리는 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 및 NMR 기반 지질 바인딩 전통과 confocal 라이브 셀 현미경 이미징를 포함 하는 necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 방법 보고.

Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

AlPcS2a 매개 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)는 살아있는 세포에서 세포내 소포(IV)의 시공간 손상을 연구하기 위한 강력한 도구입니다.

세포내 소포 파열의 기능을 연구하기 위한 광역학적 접근

미토파지는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘입니다. 그러나, 생체 내 미토파지의 평가는 신뢰할 수 있는 정량적 분석의 부족으로 인해 방해를 받는다. 여기에 제시된 것은 세포 투과성 녹색 형광 미토콘드리아 염료와 적색 형광 리소좀 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 미토파지를 관찰하기위한 프로토콜입니다.

미토콘드리아와 리소좀을 위한 형광 염료로 미토파지 시각화

이 프로토콜은 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸을 기반으로 합니다. 당사는 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-AAD 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출하며, 전체 세포를 사용하고 주사 전자 현미경을 사용하여 세포막 형태를 관찰합니다.

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

학습하세요 괴사증 중 리소좀 막 투과화를 실시간으로 모니터링하는 살아있는 세포 이미징 방법을. 형광 프로브를 활용하여 리소좀 산성도와 막 완전성 변화를 동시에 관찰할 수 있습니다.

괴사증 중 리소좀 막 투과화의 살아있는 세포 이미징

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