교세포섬유산성 단백질 및 그 질병 관련 변이체의 생화학적 분석에 대한 실험적 접근법

저의 연구는 영향을 받은 성상교세포의 GFAP 변화와 그 기능 장애가 알렉산더병으로 이어지는 과정에 초점을 맞추었습니다. GFAP를 연구하는 쉽고 따라하기 쉬운 방법을 공유합니다. 질병 관련 GFAP는 제대로 조립되지 않고 뭉치는 경향이 있으며, 특이한 변형을 가지고 있어 연구가 더 어렵습니다.

먼저, 글로우 방전 형태 바와 탄소 코팅 구리 그리드를 글로우 방전 청소 시스템에 배치하세요. 20밀리암페어로 45초간 그리드를 청소하세요. 조립 혼합물을 성문 충전 그리드에 전달합니다.

격자 가장자리를 흡수 종이로 흡수하여 과잉 액체를 제거하세요. 그 다음 그리드를 증류수로 세척하세요. 그리드에 1% 소변 아세테이트 20마이크로리터로 60초간 염색하세요.

과도한 염색 용액을 제거하고 그리드를 30초간 자연 건조시키세요. 고해상도 모드에서 100킬로볼트의 가속 전압에서 투과전자 현미경을 사용해 준비된 그리드를 조사합니다. 알렉산더병 쥐의 뇌 조직을 추출하며, 10밀리리터 10밀리리터 완충제가 포함된 듀스 균질기를 사용한다.

원심분리기로 뇌는 76,000G, 섭씨 4도에서 20분간 균질화됩니다. 그 후 10밀리리터의 Triton X-100 버퍼, 자당 버퍼, 고염 버퍼, 요소 버퍼로 차례로 추출합니다. 상청액 분획을 채취하여 Q 컬럼 버퍼에 투석합니다.

이제 다이아리시즈된 샘플을 NGC 크로마토그래피 시스템의 음이온 교환 컬럼에 적재합니다. 결합된 단백질을 Q 버퍼 내 0에서 0.5몰 염화나트륨의 선형 구배로 분당 1밀리리터의 유량으로 용출합니다. 교세포 섬유성 산성 단백질 분획을 모아 S 컬럼 완충제에 투석합니다.

이제 투석된 샘플을 양이온 교환 컬럼에 적용하고, 0에서 1몰 염화나트륨 완충액의 선형 구배로 분당 1밀리리터의 유량으로 결합된 단백질을 용출합니다. SDS 페이지와 쿠매시 블루 염색으로 도망친 분획을 분석하세요. 정제된 교세포 섬유 산성 단백질이 포함된 분획을 수집하세요.

야생형 GFAP은 시험관 내에서 균일한 10나노미터 필라멘트를 형성한 반면, R239H 돌연변이는 조밀한 응집 구조를 형성했으며, 저속 원심분리 하에서는 대부분의 야생형 GFAP가 상원액에 남아 있었고, 대부분의 R239H GFAP는 펠릿 분획에서 발견되었다. 고속 원심분리 하에서 거의 모든 야생형 GFAP와 R239H GFAP가 펠릿 분획에서 발견되어 효율적인 퇴적이 확인되었습니다. 과산화수소 처리 후 야생형 GFAP는 여러 개의 고분자량 밴드를 형성했으며, 이는 DTT에 의해 단량체로 환원되었습니다.

산화 스트레스가 없는 상태에서 R239H GFAP는 약 180킬로달톤의 고분자량 밴드를 형성했으며, 이는 단량체 형태로 전환하기 위해 높은 농도의 디티오트레이톨이 필요했습니다. 정량화 결과, 야생형 GFAP에 비해 R239H GFAP의 고분자량 형태에 더 높은 비율이 남아 있음이 확인되었습니다. 면역 블롯팅 결과, R237H 쥐 뇌에서 유입 GFAP가 유비퀴틴화된 것으로 확인되었으며, 이는 GFAP와 유비퀴틴에 대한 신호가 겹쳐지는 것으로 나타났습니다.

전자현미경 검사 결과 알렉산더병 쥐 뇌에서 유래한 GFAP가 섬유 형성에 실패했다. 저속 원심분리에서는 알렉산더병 쥐 뇌에서 나온 대부분의 GFAP가 상청액에 남아 있었고, 고속 원심분리에서는 펠릿 분획에 침전되었다. 정량화 결과 저속 원심분리와 고속 원심분리 사이에서 GFAP 분포가 상청액에서 페릿으로 이동하는 것이 확인되었습니다.

돌연변이 GFAP가 필라멘트를 어떻게 변화시키고, 집착을 유도하며, 세포를 손상시키는지에 대한 명확한 그림은 아직 밝혀지지 않았습니다. 우리 프로토콜은 이러한 메커니즘을 직접 조사합니다. 정상 및 돌연변이 GFAP를 모두 정제하는 표준화된 방법을 개발하여 단백질과 질병에서의 역할을 연구하는 것이 훨씬 쉬워졌습니다.

이 프로토콜은 필라멘트 조립, 응집 및 변형이 알렉산더병에 어떻게 기여하는지 명확히 하기 위해 정상 및 돌연변이 GFAP 준비를 간소화합니다.