표현형 및 기능 분석을 위한 HLA-G⁺ 외 영양층 정제 인간 임기 태반 조직에서

이 프로토콜은 인간 태반 조직에서 1차 인간 영양층을 정제하여 건강한 임신 및 병리학적 조건에서 기능적 특성과 면역학적 특성을 연구하기 위해 설계되었습니다. 따라서 이 프로토콜은 인간 1차 외 영양층 연구에서 겪었던 몇 가지 한계, 즉 생존 가능성을 극복할 수 있는 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 그래서 이 프로토콜은 생존력과 순도를 높이기 위해 최적화되어 있습니다.

우선, 인간 태반 샘플을 채취하세요. 태아 쪽이 위를 향하게 태반을 놓아 탯줄 삽입 부위가 보이도록 하세요. 양막을 외측막에서 탯줄 삽입 부위 쪽으로 손으로 떼어내어 제거하세요.

그 다음 가위로 양수를 잘라서 버리세요. 맥락막을 태반 밑부분에서 위쪽으로 2인치 길이로 잘라내고, 각 띠는 태반에 붙어 두세요. 융모막막 스트립을 두 손가락 위에 걸쳐 두고, 십지개막 쪽은 위를 향하게 합니다.

멸균된 굽은 팁 핀셋으로 모체의 두(decidua parietalis)를 부드럽게 머리에서 긁어내세요. 림프구 분리를 위해 20밀리리터의 PBS가 들어 있는 50밀리리터 원뿔관에 데시두아 두리에탈리스를 수집합니다. 그 다음 융모막을 별도의 50밀리리터 원뿔 튜브에 모아 20밀리리터의 워시 매체 A를 넣습니다. 가위를 사용해 50밀리리터 튜브 안의 융모막을 2제곱밀리미터보다 작은 조각으로 잘라냅니다.

튜브에서 세척 매체 A를 버리세요. 조직을 PBS로 반복해서 세척하여 상정액이 맑아질 때까지 유지하세요. 태반 박리를 위해서는 태반을 모체 쪽이 위를 향하게 하여 혈전을 제거하세요.

멸균 가위를 사용해 괴사, 석회화, 허혈 부위를 피하면서 태반 기저판 조각을 잘라내세요. 배모가 위를 향하게 하여 손가락 위에 데시두아 베이스살리스 조각을 올려놓습니다. 그 다음 가위로 융모를 조심스럽게 제거하여 얇은 융모층만 남은 2밀리에서 3밀리미터 두께의 막을 만듭니다.

기저 십추 조직을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 20밀리리터 PBS를 담아 채취합니다. 그 후 조직을 2제곱밀리미터보다 작은 조각으로 잘라냅니다. 다음으로, 튜브에서 PBS를 버리세요.

상정액이 피가 보이지 않고 투명해질 때까지 기저 치추부를 PBS로 반복해서 세척하세요. 그 후 15밀리리터의 조직 부유물을 두 개의 50밀리리터 원뿔 튜브로 나누었습니다. 모든 튜브에 PBS를 채우세요.

튜브를 200G에서 1분간 원심분리한 후 상정액을 부어내세요. 300밀리리터 유리병에 따뜻한 조직 소화 효소 칵테일 150밀리리터를 넣으세요. 병에 30밀리리터의 융모막을 넣으세요.

20밀리리터 따뜻한 DMEM/F-20과 80밀리리터 따뜻한 조직 소화 효소 칵테일을 두 개의 300밀리리터 유리병에 추가하세요. 그 다음 각 병에 7.5밀리리터의 데시두아 베이스리스를 넣으세요. 병을 물에 담가서 부화시키세요.

15분 부화 기간 동안 모든 병을 3분에서 4분마다 흔들어 주세요. 소화 후에는 40 메쉬 크기의 금속 체로 조직을 걸러냅니다. 그 다음 워시 미디엄 B를 넣어 조직을 헹구고 젤라틴 같은 물질을 녹여줍니다.

소화되지 않은 조직을 다시 유리병에 옮기고 소화를 반복하세요. 그 후 셀 현탁액을 100마이크로미터 필터를 통해 50밀리리터 원뿔형 튜브로 필터링합니다. 첫 번째와 두 번째 소화 세포는 분리하세요.

그 다음 셀 현탁액을 650G에서 8분간 원심분리합니다. 상원액은 버리세요. 같은 조직 종류와 소화 수의 펠릿을 하나의 튜브에 합칩니다.

그 다음 최대 25밀리리터까지 워시 미디엄 B로 부피를 보완하세요. 조직 유형과 소화 번호가 적힌 50밀리리터 원뿔형 튜브 4개에 12밀리리터 피콜을 추가하세요. 셀 서스펜션을 조심스럽게 피콜 위에 겹겹이 붙이세요.

그 후 800G에서 실온에서 20분간 원심분리기를 하면서 깨지지 않습니다. 섬유질 배지 경계면에서 세포층을 조심스럽게 흡인하여 깨끗하게 라벨링된 튜브로 옮기세요. 그 다음 세척 미디엄 B를 튜브에 채우고, 650G에서 원심분리기를 8분간 한 뒤 펠릿을 다시 부탁합니다.

재현탁된 펠릿을 조직 유형과 소화 번호가 표시된 멸균 형광 활성화 세포 분류관에 넣습니다. 항-CD45 BV785, 항-HLA GAPC, 항-EGFR1 BV711 항체를 추가합니다. 어두운 상태에서 실온에서 20분간 배양하세요.

세척 배지 B에 세포를 세척하고 재현탁한 후, 즉시 40마이크로미터 세포 체에 통과시킵니다. CD45 음성 HLAG 양성, EGFR 양성, 양성 외영양층을 1밀리리터 EVT 배양지 A가 포함된 튜브에 분류하라. 계통 마커의 유동 세포분석 결과 4일째까지 원발성 모낭외영양층 배양이 유효함을 보였다. 24시간, 48시간, 72시간 배양 후 1차 융모세포 및 기저 십추 HLAG 양성 영양층의 대표 광학 현미경 이미지를 촬영하였다.

융모외영양층은 다형성 HLAC와 면역억제 공동억제 분자를 발현하였다. 융모외 영양층은 HLAC, PD-L1, PD-L2, HLA-E의 발현을 증가시켰으나, 활성화된 림프구와 72시간 동안 공동 배양했을 때 PVR과 B7H3의 발현은 증가하지 않았다. 활성화된 림프구와의 공동 배양 후 융합 영양소 사망률 증가는 관찰되지 않았습니다.

이 프로토콜은 과학자들이 다양한 검사에 일차 외영양층을 사용할 수 있게 해줍니다. 이 장점은 세포 배양, 냉 배양, 유세포 분석, 단백질체학, 전사체학 등을 활용한 매우 좋은 고수율 융모외영양 조직을 이용해 분석할 수 있는 높은 생존율입니다. 그래서 저희 프로토콜에서 가장 중요한 점 중 하나는 신선한 태반 재료를 사용해야 한다는 점입니다.

냉장 보관할 수 없어요. 영양모세포는 죽는 것을 좋아하므로, 출산 직후, 가능하면 출산 후 2시간 이내로 태반 조직을 확보하고 항상 실온에 보관하세요. 이는 매우 생존력 있는 외 영양층을 얻는 데 매우 중요합니다.

따라서 이러한 1차 영양층을 사용할 수 있는 더 추가적이고 진보된 혁신적 방법 중 일부는 장기 세포 배양입니다. 그래서 1차 4일 세포 배양을 구축하는 데 사용할 수 있습니다. 그래서 세포는 최대 96시간 동안 생존할 수 있는데, 이는 꽤 긴 시간이며, T세포나 NK 세포 같은 면역 세포로 냉 배양을 할 수 있게 해줍니다.

또 다른 혁신은 아오키가 처음 설명한 방법을 사용해 영양층 유사 세포주를 구축할 수 있다는 점이며, 우리는 이 배양물에 적용해 장기적으로 증식하는 세포 유형을 확립하여 게놈 편집 및 기타 장기 배양 분석에 활용할 수 있습니다. 그래서 장기 세포 배양을 포함한 이러한 혁신적인 방법을 사용하면, 유전체 편집, 녹아웃, 녹인 유전자, 단백질을 적용하고, 일부 영양층을 과발현시켜 영양층이 어떻게 내성을 강화하는지, 또는 면역 집단과 상호작용할 때 면역과 더 많은 세포독성을 허용하는 메커니즘을 훨씬 더 자세히 이해할 수 있는 장기 메커니즘 배양을 설계하는 데 큰 도움이 될 수 있다고 생각합니다.