나이메헌 혈류 분석 분석: 단일 웰에서 트롬빈과 플라스민 생성의 동시 형광 생성 측정

저의 연구는 2차 혈류와 섬유소해를 함께 측정하여 전반적인 정혈 균형을 측정하는 데 중점을 두고 있습니다. 대부분의 현재 검사는 응고나 섬유소용해의 분리된 구성 요소를 평가합니다. 이 분석법은 하나의 분석에서 두 과정을 동시에 측정합니다.

먼저 형광판 리더기를 켜고 37도까지 평형을 맞춥니다. 소프트웨어에서 필터 설정을 설정하여 파장 쌍 수를 2로 설정하세요. 트롬빈의 경우 여기 파장을 355나노미터, 플라스민의 경우 485나노미터로 설정합니다.

그 다음 트롬빈은 방출 파장을 460나노미터, 플라스민은 525나노미터로 설정했습니다. 다음으로, 플레이트 타입을 96 웰 그라이너 플랫 바텀 블랙 마이크로플레이트로 설정하세요. Read Area로 이동하여 플레이트당 최대 20개의 웰을 사용해 플레이트 레이아웃을 정의하세요.

PMT와 광학 설정을 설정하려면 PMT 게인을 200볼트로, 읽기당 플래시 수를 6회로 설정하세요. 그 다음 타이밍으로 이동해 총 1시간 9분 30초, 30초 간격의 타이밍 설정을 확인하세요. 첫 읽기 3초 전에 쉐이크를 확인하려면 Shake로 이동하세요.

더 많은 설정으로 이동하여 읽기 순서가 열로 설정되어 있는지 확인하세요. 읽기 전 화합물 전송 설정을 설정하려면 화합물 전송 횟수를 1, 초기 부피를 120 마이크로리터로 설정하세요. 피펫 높이가 130 마이크로리터, 부피가 20 마이크로리터, 속도가 초당 1마이크로리터, 타임 포인트가 14초인지 확인하세요.

Compound Source에서 96 웰 컴파운드 플레이트 포맷을 확인하고, 특히 Beckman 96 2.3밀리리터 옵션을 선택하세요. 피펫 팁 레이아웃 설정을 올바른 컬럼을 선택하여 확인하세요. 이제 복합 팁 열로 이동해 올바른 열을 선택하세요.

마이크로플레이트 셰이커 온도를 37도로 설정하고 사용 전에 온도를 확인하세요. 그 다음 진동 강도를 분당 1,100회전으로 설정하세요. 다음으로 환자의 혈장과 정상 고인 혈장을 37도 수조에 최대 10분간 녹입니다.

혈장 샘플을 충분히 혼합하여 완전한 해동 여부를 확인하고, 눈에 띄는 냉침전물이 없는지 확인하세요. 피펫을 사용해 각 샘플마다 새 피펫 팁을 사용해 미리 선택된 웰에 환자 혈장 또는 일반 웅덩이 혈장을 80마이크로리터 추가합니다. 그 다음 48마이크로리터의 세팔린과 48마이크로리터의 조직 인자를 혼합하여 기질 혼합물을 준비합니다.

여기에 240마이크로리터 트리소듐 클로라이드 버퍼를 추가하고, 96마이크로리터의 트롬빈 기질과 48마이크로리터의 플라스민 기질을 피펫으로 채취합니다. 각 웰에 20마이크로리터의 기질 혼합물을 피펫팅해 추출합니다. 악수한 후에 하세요.

이제 마이크로플레이트를 형광판 리더기에 넣고 37도 섭씨에서 몇 분간 평형을 유지합니다. 염화삼나트륨 완충제, 염화삼중나트륨 염화칼슘 완충제, 조직 플라스미노겐 활성화제를 결합하여 시작 시약을 준비합니다. 완전히 소용돌이를 섞어.

화합물 컬럼의 모든 행에 시작 시약 혼합물을 피펫으로 채취합니다. 시작 시약 혼합물이 담긴 판을 소스 서랍에 삽입하고 형광 측정을 시작합니다. 70분 동안 30초마다 형광 신호를 기록하세요.

측정 내내 플레이트를 37도 섭씨로 유지하세요. 데이터 분석을 위해서는 각 우물별 시간점과 형광 값을 포함하는 표로 동역형 형광 데이터를 내보내세요. 1차 미분을 계산하고 각 웰의 효소 생성 곡선을 그려 시간에 따른 트롬빈 또는 플라스민 생성을 시각화합니다.

이 지혈 분석은 혈전과 플라스민 생성의 동시 시간 분해 측정을 가능하게 하여 응고와 섬유소용해의 통합 평가를 제공하였습니다. 트롬빈 생성 곡선에서 지연 시간, 최대 높이, 트롬빈 전위 등 여러 매개변수를 도출할 수 있습니다. 더 긴 지연 시간, 낮은 피크 높이, 감소한 트롬빈 전위는 트롬빈 생성 저하를 나타냅니다.

플라스민 생성 곡선은 또한 섬유소 용해 시간과 플라스민 피크 높이 등 여러 매개변수를 제공합니다. 피브린 용해 시간이 짧고 최고 높이가 높아진 것은 혈장 생성이 향상된 것을 반영합니다. 세 명의 건강한 대조군과 정상 집합 혈장에서 측정한 트롬빈 및 혈장 생성 곡선은 정상 혈류 기능의 기준 프로파일로 재현 가능한 최고 높이 종료 타이밍을 보였다.

인자 V 활성이 3%인 환자에서는 트롬빈 생성이 완전히 없었다. 하지만 플라즈마 생성은 소폭 증가했다. 인자 V 활성이 44%인 환자는 혈장 생성이 정상 범위 내에 있는 동안 혈장 생성이 감소하고 지연 시간이 길고 최고 높이가 감소하는 모습을 보였다.

알파-2-항플라스민 결핍 상태에서는 알파-2-항플라스민 활성이 감소함에 따라 혈장 생성이 증가했습니다. 활성 23%의 동형접합 환자는 플라스민 생성이 조기에 시작되고, 섬유소 용해 시간이 짧으며, 혈장 피크가 더 높았습니다. 이러한 변화는 73% 활성의 이형접합 환자에서도 관찰되었으나, 그리 두드러지지 않았습니다.

이 지혈 분석법은 희귀 응고인자 결핍, 섬유소용해 장애, 정혈 약물 효과 연구에 적합합니다. 주요 과제는 기술의 표준화와 결과를 정규화하여 방 및 실험실 간 비교 가능성을 높이는 것입니다. 향후 연구는 분석의 자동화와 전혈 또는 플레이트 풍부 혈장과의 호환성을 위한 적응 개발에 집중할 수 있습니다.