CAR T 세포에서 CRISPR-Cas9 스크리닝 개선: 라이브러리 준비를 위한 정교한 방법

저희 연구는 CRISPR 스크리닝 접근법을 사용하여 표적을 식별하고 CAR T 세포 치료의 효과를 향상시키는 데 중점을 두고 있습니다. 현재 실험의 과제는 CRISPR 스크리닝 접근법에서 재현 가능한 실험실 방법 달성을 포함합니다. 우선, T 세포가 포함된 24웰 플레이트에 미리 정해진 양의 렌타 바이러스 CRISPR 라이브러리를 추가하세요.

최종 농도인 8마이크로그램/밀리리터의 다뇌를 추가하세요. 고르게 분포되도록 부드럽게 섞으세요. 세포를 700G에서 32도 섭씨에서 90분간 원심분리하여 스핀 페션을 수행합니다.

원심분리 후에는 조심스럽게 판을 원심분리기에서 분리하세요. 배지를 신선한 T세포 배양주로 교체하세요. 6시간 후에는 감염 배수 3으로 CAR 렌타 바이러스 벡터를 추가합니다.

세포를 37도 섭씨에서 4일간 배양하세요. 배양이 완료되면 CAR T 세포를 채취하세요. PBS로 한 번 씻으세요.

그 후 아크라딘 오렌지 프로피듐 요오다이드로 세포를 염색하고, 형광 셀 카운터에서 셀을 세세요. 전기천공 완충액에 4마이크로몰 Cas9 용액을 준비합니다. 50마이크로리터의 Cas9 용액에 6개의 CAR T 세포를 5곱 10제곱으로 재현탁합니다.

그 후 기포가 생기지 않도록 멀티웰 쿠베테 스트립의 각 웰에 세포 현탁액 50마이크로리터를 피펫팅합니다. 보이는 기포는 피펫 팁으로 웰 가장자리를 부드럽게 움직여 제거하세요. 확장 T-셀 3 프로그램을 사용해 CAR T 세포를 뉴클레오프합니다.

큐벳을 37도 섭씨에서 인큐베이터에 40분간 보관하세요. 핵분리된 세포를 T세포 성장 배지에 재현탁합니다. 그 후 37도 섭씨에서 3일간 다시 배큐합니다.

형광 세포 계수기에서 아크라딘 오렌지 프로피듐 요오디아 염색을 사용해 세포 수를 세세요. 세포 밀도를 10의 6 세포 제곱으로 조절한 후, 푸로마이신을 최종 농도인 2.5 마이크로그램/밀리리터로 첨가합니다. 6일간의 인베이킹 후 유세포분석을 이용해 CAR 양성 세포의 비율을 평가합니다.

그 다음 CAR T 세포 집단을 분류하고 건조 세포 펠릿을 영하 80도에 보관합니다. 세포 및 조직 DNA 추출 방법을 사용하여 샘플에서 유전체 DNA를 추출합니다. 이중 가닥 DNA 정량 키트를 사용해 유전체 DNA 농도를 측정하세요.

다음으로, 최대 5마이크로그램의 유전체 DNA와 선택된 제한효소 20단위를 총 50마이크로리터 단위로 소화합니다. 37도 섭씨에서 열순환기에서 하룻밤 배양하세요. 다음 날, 10밀리리터의 밀리몰라트리스 HCL과 50밀리리터의 신선한 70% 에탄올이 포함된 용출 완충제를 준비합니다.

소화된 제품 100마이크로리터를 소용돌이 구슬이 들어있는 튜브에 피펫으로 채취합니다. 피펫으로 현탁액을 충분히 섞고 실온에서 5분간 배양한 후 다시 5분 정도 자석화하세요. 자석 위에 있는 동안 상청액을 버리고 70% 에탄올 용액 200마이크로리터를 펠릿을 방해하지 않고 피펫으로 채취합니다.

30초 후 상청액을 버리고 알코올 세척을 두 번 더 합니다. 두 번 세탁한 후 구슬을 2분간 말린 후 자석에서 꺼내세요. 엘루시안 버퍼와 피펫 40마이크로리터를 추가하여 비드를 재현탁합니다.

현탁액을 2분간 자석화한 후 상원액을 새 튜브로 옮깁니다. 1밀리그램의 소용돌이 스트렙타비딘 자기 구슬이 들어있는 튜브에 1개의 워시 결합 버퍼 1개를 추가하세요. 피펫으로 버퍼 내 비드를 재현탁하세요.

그 후 현탁액을 자석에 1분간 올려놓고, 상원액을 버린 뒤 두 번 더 세척합니다. 세 번째 세척 후에는 비즈를 두 개의 워시 결합 버퍼에 다시 사용합니다. 그 다음 정제된 소화 산물에 10마이크로몰라 비오티닐화 풀다운 프라이머 5마이크로리터를 첨가합니다.

혼합물을 96도 도(씨) 건조 목욕에 5분간 부화시킨 후 즉시 얼음 위에 5분간 식힙니다. 반응에 미리 세척된 스트렙타비딘 자기 구슬 1밀리그램을 추가하여 반응과 스트렙타비딘 구슬 양이 같도록 합니다. 실온에서 20분간 배양하고 4분마다 재현탁하세요.

비즈를 5분간 자석화한 후, 1개의 x 워시 결합 버퍼로 세 번 세척합니다. 마지막으로, 결합된 sgRNA 카세트가 포함된 구슬을 50마이크로리터의 엘루시안 완충제에 재현탁합니다. sgRNA 라이브러리를 준비하고 증폭하여 서열 분석하세요.

항생제 선택 후, CRISPR 라이브러리로 형질전환된 CAR T 세포는 푸로마이신 치료 후 두 기증자 모두에서 생존과 증식을 지속하였습니다. CRISPR 라이브러리 전이가 없는 미형질전면(untransduced) T세포와 CAR T 세포는 항생제 선택 하에서 유사한 증식을 보이지 않았으며, 음성 대조군으로 작용했습니다. NDEL과 PSPXI를 이용한 제한효소 소화는 단일 가이드 RNA 카세트를 보존하면서 단편화된 유전체 DNA를 생성했습니다.

그 후 sgRNA를 포함한 조각을 선택적으로 증폭했습니다. 피어슨과 스피어먼 상관관계 결과, 단일 가이드 RNA 리드 수와 라이브러리 복잡도는 플라스미드 라이브러리와 비교했을 때 기증자 게놈 DNA 샘플에서 유지되었습니다. 견고한 랭크 집계 분석을 통해 Cas9 편집 후 두 기증자 모두에서 유의미하게 풍부하거나 감소한 유전자가 확인되었습니다.

경로 풍부화 분석 결과, 확인된 유전 조절자와 관련된 주요 유전자 온톨로지 용어가 드러났습니다. 우리 프로토콜은 기존 실험실 기법에 대한 신뢰할 수 있는 대안으로 CRISPR 선별 접근법을 제공합니다. 우리의 연구 결과는 보다 재현 가능하고 견고한 CRISPR 선별 프로토콜 개발을 지원함으로써 이 분야의 발전에 기여할 것입니다.

우리의 결과는 유전자를 식별하는 길을 열었으며, 이를 조절하여 CAR T 세포의 표현형과 기능을 향상시킬 수 있습니다.