생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

노화 세포의 공간 분석은 노화, 암, 면역, 정상 조직 항상성과 같은 과정에 미치는 영향을 이해하는 데 중요합니다. 노화 세포의 검출은 여러 바이오마커를 프로파일링하는 데 의존합니다. 다중화 면역형광 영상은 단일 조직 절편 내에서 이들을 고처리량으로 프로파일링할 수 있게 합니다.

우선, 최대 크기가 4 x 2센티미터 정사각형 5마이크로미터 두께의 포르말린 고정 및 파라핀 내장(FFPE) 조직 절편이 양전하를 띤 현미경 슬라이드에 중앙에 장착되어 있으며, 커버슬립리스 슬라이드 홀더의 관람창 내에서 명확히 보인다는 것을 확인하세요. 샘플 준비 과정을 수동으로 디클로킹 챔버를 사용하거나 자동 스테인을 사용해 수행하세요. 준비된 슬라이드를 커버슬립리스 슬라이드 홀더에 넣습니다.

상단과 오른쪽 가장자리를 금속 스톱에 맞추세요. 슬라이드를 두 손으로 동시에 고정하여 플라스틱 캠을 닫힌 자물쇠 위치로 돌리세요. 슬라이드가 완전히 평평하게 고정되어 있고 홀더 안에서 흔들리지 않는지 확인하세요.

ClickWell을 놓고, 챔버를 슬라이드 위에 삽입한 뒤, 양손으로 사이드바를 집어 압력을 줄이고 파손을 방지하세요. 입구 포트를 통해 50% 글리세롤이 포함된 마운팅 매체를 2밀리리터 주입하여 인산염 완충 식염수에 넣습니다. 슬라이드 왼쪽에 바코드 라벨을 어느 방향으로든 붙인 후 촬영을 진행합니다.

영역 선택 및 자가형광 분석을 위해 Mx 워크플로우 버전 4204, 다중화 영상 획득 소프트웨어를 열어라. Tools 버튼을 클릭하여 Protocol Publisher를 선택하세요. 멀티플렉스 프로토콜 퍼블리셔 팝업에서 프로토콜 이름을 입력하세요.

Create Setup Round를 클릭한 후 다음 프로토콜 추가 라운드를 클릭하여 여러 라운드의 바이오마커 라벨링을 생성합니다. 게시를 클릭한 후 팝업 창에서 확인을 선택하세요. 가상 H&E 이미지를 위해 Cy3 채널을 획득하세요.

슬라이드를 클릭한 후 새 배치 생성. 프로토콜 이름을 선택한 후 슬라이드 ID를 입력하세요. 슬라이드 추가를 클릭한 후 멀티플렉스 실험 워크플로우를 생성하려면 배치 생성(Create Batch)을 선택하세요. Cell DIVE 획득 소프트웨어를 열어라.

슬라이드를 현미경에 로드하려면 '로드'를 클릭하세요. 도구 드롭다운 메뉴에서 그리드 아이콘을 클릭하여 원하는 영역을 정의하고, 이동 도구를 사용해 정의된 영역을 재배치하세요. 다음으로, Draw 도구를 사용해 필요 없는 필드를 삭제하고, 각 필드마다 최소 두 개의 인접 필드가 있어 스티치 문제를 방지한 후 'Save Regions'를 클릭하세요.

Mx 워크플로우 창에서 Viewer QC를 클릭하여 Cell DIVE 뷰어 페이지를 열고 조직 이미지를 10배 확대로 시각화하세요. 이미지 보정 아이콘을 클릭하여 이미지 밝기를 조정하고, 팝업 창에서 'Pass and Reload Slide'를 선택하려면 '품질 검사 제출(Submit QC)'을 클릭하세요. 이미지가 다시 로드되면 ROI 추가를 클릭하여 관심 영역을 그리고 조정하세요.

원하는 시야를 선택하고 ROI를 반복하세요. 다음으로 '실험실로 보내기'를 클릭하세요. 슬라이드를 불러오면 20배 자가형광 이미지 획득이 시작됩니다.

Imaging QC 메뉴에서 특정 슬라이드 ID에 해당하는 체크박스를 선택한 후 Viewer QC를 클릭하세요. 불맞은 부분이나 아티팩트를 스캔하기 위해 로드된 이미지를 확대하세요. 각 채널의 배경 이미지를 확인하며, 최종 바이오마커 신호에서 이 이미지를 빼는 것입니다. QC 제출을 클릭한 후 '통과 종료'를 선택해 배경 이미지를 생성하세요.

순차적인 바이오마커 염색 전에 항체를 13,000G에서 1분간 실온에서 원심분리하여 인위물을 제한합니다. 항체 용액을 0.3% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한 인산염 완충 식염수(PBS)에 1:200 희석으로 준비합니다. ClickWell 포트에서 피펫팅으로 마운팅 매체를 제거하세요.

그리고 0.01% 트윈 20 또는 PBST 함유 PBS 2밀리리터로 5분간 세 번 세척하세요. 염색 챔버 내에서 샘플 전체를 덮기 위해 포트 내에 350마이크로리터의 항체 용액을 추가하세요. 상온에서 1시간 배양하세요.

다음으로 ClickWell 포트에서 항체 용액을 피펫으로 빼냅니다. 그리고 PBST 2밀리리터로 5분간 세 번 세척하세요. 마운팅 매체 2밀리리터를 추가하세요.

ClickWell 홀더를 현미경에 삽입하고 슬라이드를 장전하면 20배 바이오마커 이미징을 시작합니다. 블렌드 편집기와 이미지 보정 옵션을 사용해 영상 QC를 수행하고 이미지 QC 평가를 제출하세요. ClickWell 포트에서 마운팅 매체를 피펫으로 빼내고, 2밀리리터 PBST로 5분간 세 번 세척합니다.

염료 불활성화 용액은 사용 전에 신선하게 준비하세요. PBST를 제거한 후에는 각 슬라이드마다 2밀리리터의 염료 불활성화 용액을 추가하세요. 슬라이드 홀더에서 15분간 부화하세요.

ClickWell 포트에서 염료 불활성화 용액을 피펫으로 빼내고, 2밀리리터 PBST로 5분간 세척합니다. 2밀리리터의 마운팅 매체를 추가하고 ClickWell 홀더를 현미경에 삽입하면 자동 라운드 특이적 20배 자가형광 이미징이 시작됩니다. 완료 후 화면에 지시된 QC 단계를 진행하여 워크플로우를 진행하세요.

필요한 만큼 순차적으로 염색, 염료 불활성화, 다중화 영상을 반복하여 완료할 때까지 계속합니다. HALO 소프트웨어를 사용하여 조직 코어의 다양한 영역에서 마커의 위치를 시각화하기 위해 다양한 채널을 선택하세요. 분석 버튼을 클릭한 후 전체 이미지를 선택하여 개별 마커의 정량적 지표를 분석하세요.

결과를 클릭하여 분석된 조직 코어의 총 세포 수와 특정 마커를 발현하는 세포 하위 집합을 확인하세요. 자동 슬라이드 스테인너 기반 방법에 비해 수동 탈폐 챔버 기반 방법은 조직 박리와 탈락 또는 미끄러짐이 특징인 조직 인공물의 빈도가 더 높았습니다. 대표적인 췌장 조직에 대한 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 정량화 결과, p16 양성 세포는 낮은 LB1 수치와 연관되어 있어 노화 관련 표지 패턴과 일치하는 프로필을 보였습니다.

Z 점수 정규화된 열맵은 p16 양성 라민-B1 음성 노화 표현형의 다양한 조직 분포를 보여주며, 폐, 부신, 뇌하수체에 노화 세포가 높은 농도를 나타내며, 이는 p16 상승과 LB1 수치 감소에 해당합니다. 반대로 맹장, 림프절, 비장은 낮은 노화를 보였으며, 높은 LB1과 낮은 p16 발현을 유지하였다. 이 프로토콜은 단일 현미경 슬라이드 내에서 노화, 구조 및 면역 바이오마커의 조합을 탐구할 수 있게 합니다.

단일 샘플 내에 여러 마커를 결합함으로써 조직 구조와 노화 세포 분포의 공간 분석을 수행할 수 있습니다. 향후 응용 분야로는 여러 조직 유형에 걸친 노화 바이오마커의 대규모 프로파일링과 공간 오믹스와의 통합을 통해 세포 이질성을 더 잘 해명하는 것이 포함됩니다.