FACS를 이용한 쥐 피질 조직에서 주리세포 분리 단세포 시퀀싱

저희 연구는 뇌 기생충의 혈관 역할과 신경혈관 부위 내 상호작용에 초점을 맞추어 대뇌 기능을 이해하고자 합니다. 저영상 및 장기 과정 내 공간적 FACS는 뇌혈관 내 기생충 기능을 지도화하여 위치, 특정 역할 및 치료 표적을 드러냅니다. 우선, 안락사 시행된 쥐의 머리와 목 부위에 75% 에탄올을 뿌립니다.

메스를 사용해 후두에서 전두골 부위까지 중앙 두피 절개를 하여 두개골을 노출시킵니다. 양측 안도 앞쪽에 횡방향 절개를 한 뒤, 소뇌 하부 가장자리를 따라 측면 절개를 하여 두개골 기저를 분리합니다. 시상봉합선을 따라 뒤쪽에서 앞쪽으로 종방향으로 절개합니다.

두개막과 듀라마터를 함께 들어 올려 뇌를 노출시킵니다. 수술용 가위를 사용해 뇌를 부드럽게 들어 올리면서 시신경과 연수 척수 연결을 절단합니다. 손상을 피하기 위해 온전한 뇌를 10cm 두께의 얼음 차가운 PBS 10밀리리터가 들어있는 접시에 조심스럽게 넣으세요.

뇌를 알루미늄 호일 위에 옮겨. 지주막하 공간을 노출하세요. 겸자로 경막을 제거한 후에는 행크의 밸런스 소금 용액으로 헹구세요.

휴지를 필터 종이에 옮기고 피아마터를 말아 제거하세요. 면도날로 후각구와 가장 큰 부분을 잘라내어 버리고, 뇌를 2밀리미터에서 3밀리미터 두께의 절단으로 나누세요. 뇌량을 따라 대뇌 피질을 분리하세요.

피질 조직을 3밀리리터 얼음 조직 채취 완충제가 들어 있는 앰풀에 옮깁니다. 수술용 메스를 사용해 조직과 앰플을 약 1x1mm 단위로 다지고 5분 이내에 다져서 조직의 신선도를 유지합니다. 조직 채취 완충제가 포함된 사전 세척 피펫 팁.

그 후 피펫을 수직으로 잡은 채 천천히 다진 조각을 팁 꼭대기 쪽으로 흡인합니다. 조각을 미리 냉각된 15밀리리터 원심분리관에 부드럽게 배출하세요. 원래 앰플은 PBS 생리식염수에 2% FBS로 세척하세요.

세척물을 같은 원심분리기 튜브에 옮기고 300G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상청액은 버리세요. 각 펠릿을 CD 효소 작용액 3밀리리터에 다시 현탁하세요.

현탁액을 세 개의 튜브로 균등하게 분할하고, 추가 효소 용액을 추가하여 튜브당 최종 부피 5밀리리터를 만든다. 튜브를 37도 섭씨의 하이브리드화 오븐에서 100분간 인큐베이션하고, 100G에서 궤도 진동을 합니다. 배양 중에는 1밀리리터의 dnase 1 용액을 2% FBS 10밀리리터에 PBS에 첨가합니다.

300G, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하여 소화를 종료하세요. 그 후 각 펠릿을 1밀리리터의 조직 해리 용액에 다시 매립합니다. 기계적 해리를 돕기 위해 용액을 100번 피펫으로 돌려주세요.

다음으로, 모든 현탁을 하나의 50밀리리터 원심분리관에 모으세요. 각 튜브를 2밀리리터의 버퍼로 헹구고 워시를 섞으세요. 300G에서 4도에서 5분간 원심분리한 후 가장 윗층을 버린 후, 20% BSA 12.5밀리리터를 넣고 뒤집어 혼합합니다.

원심분리기 1000G, 섭씨 4도에서 20분간 돌립니다. 이제 바닥 펠릿을 모아 상원액을 새로운 50밀리리터 원심분리관으로 옮기세요. 다시 원심분리하기 전에 부드럽게 다시 부드럽게 부탁하세요.

각 펠릿을 2밀리리터 2% FBS 소포에 PBS에 재현탁하세요. 그 다음 두 서스펜션을 하나의 튜브로 합치세요. 결합 현탁을 300G, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다.

상청액을 버린 후, 마지막 알갱이를 2% FBS 2밀리리터에 다시 현탁합니다. 15밀리리터 원심분리관 4개에 각 콜당 22%의 4밀리리터를 준비합니다. 각 구배에 0.5밀리리터 셀 현탁액을 부드럽게 층층이 쌓고, 560G에서 4도 섭씨에서 10분간 원심분리기를 사용한다.

상정액을 흡인한 후, 각 펠릿을 HBSS BSA 포도당 완충액 1밀리리터에 다시 부탁합니다. 그 다음 서스펜션을 새로운 15밀리리터 튜브로 당기세요. 퍼콜 튜브를 2밀리리터의 버퍼로 헹구고, 300G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리하기 전에 워시를 섞으세요.

유세포분석의 경우, 슈퍼나던트를 흡인한 후 1밀리리터의 HBSS BSA 포도당 완충제에 펠릿을 다시 현탁합니다. FC 수용체 차단 시약 5마이크로리터를 추가하고 4도 섭씨에서 5분간 배양합니다. 그 후 피펫으로 형광 결합된 항체를 현탁액에 적발하여 배양합니다.

세포를 HBSS BSA 포도당 완충액 6밀리리터로 세척하세요. 그 후 300G, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 상정액을 흡인한 후, 1밀리리터의 버퍼에 다시 담아두세요.

7개의 아미노 액티노마이신 D 용액 200마이크로리터를 추가한 후 얼음 위에 10분간 배양합니다. 그 다음 최종 용량을 HBSS 버퍼와 BSA와 포도당을 보충한 상태로 2밀리리터로 조절합니다. 분류용 수집관 내부 표면을 1% BSA 용액으로 헹구세요.

과잉 용액을 흡입하여 각 튜브에 정확히 1밀리리터의 용액을 남겨둡니다. 배분된 세포를 받으려면 튜브를 얼음 위에 보관하세요. 뇌 조직에서 해리된 세포는 유세포 분석 과정에서 세포 잔해를 배제하기 위해 순차적으로 전방향 산란 영역과 측면 산란 영역으로 게이트되었습니다.

CD45 양성 및 CD41 양성 이중 양성 사건은 조혈 세포와 혈소판 오염물질을 제거하기 위해 배제하였다. CD13 양성 혈관벽 세포가 풍부하게 관찰되었습니다. 그리고 7개의 아미노 액티노마이신 D 음성 게이팅을 사용한 후 CD31 음성 선택을 통해 기생충을 분리하는 세포자멸 세포를 배제하였다.

유세포분석 결과 핵화된 세포가 전체 사건의 59.8%를 차지하는 것으로 나타났습니다. CD13 양성 세포는 전체 사건의 1%를 차지했습니다. 그리고 최종 CD13 양성 기생충 집단은 전체 사건의 0.7%를 차지했습니다.

분류된 세포의 UMAP 차원 축소는 분리된 집단 내에서 세포 이질성을 나타내는 6개의 뚜렷한 주요 군집을 밝혀냈다. Z-스코어 정규화 열맵 분석 결과, 기생충 마커 유전자는 0번부터 3번까지의 클러스터에서 매우 높고 주로 발현된다는 것이 밝혀졌다. 군집 비율 분석 결과, 0부터 3까지 군집이 전체 인구의 87.1%를 차지했습니다.

평활근세포 마커는 클러스터 4에서 10.14%, 섬유아세포 마커는 클러스터 5에서 2.77%로 풍부했으나, 이 프로토콜은 연구자들이 후속 단일 세포 시퀀싱 및 기능 분석에 적합한 고순도 웨어러블 기생충을 분리할 수 있게 합니다. 주요 과제는 고도로 특이적인 기생충 표지자의 부재, 복잡한 격리, 그리고 장기 오염 위험 증가입니다. 향후 연구는 기생충 특이적 표지 규명에 집중하여 분리 개선, 더 깊은 기능 특성 분석, 표적 치료 연구를 가능하게 할 수 있습니다.