조직 공학 응용을 위한 인간 피부 세포 내 터널링 나노튜브 탐지의 표준화 방법

우리는 인간 피부 세포 사이의 터널링 나노튜브를 신뢰성 있게 탐지하고 분석하는 방법을 개발했으며, 이들이 피부 재생에서 차지할 잠재적 역할을 연구했습니다. 저희 프로토콜은 고정 샘플이나 1차 인간 피부 세포를 대상으로 설계되었습니다. 피부 생물학과 조직 재생 관련 연구에 유용합니다.

우선, 적절한 배지를 포함한 60밀리미터 접시에서 인간 표피 각질세포와 피부 섬유아세포를 해동하여 배양합니다. 소생 시 각질구에 Y-27632를 보충하여 최종 농도인 5마이크로몰라까지 강화합니다. 모든 배양물을 가습 인큐베이터에서 약 80% 융합률에 도달할 때까지 37도 섭씨로 유지하세요.

그 다음 배양지를 배양 접시에서 제거하세요. 세척 중 생리적 pH와 삼투압을 유지하기 위해 PBS 1밀리리터로 세포를 잠시 헹군습니다. PBS를 완전히 흡인하세요.

0.05% 트립신 EDTA 1밀리리터를 추가하여 세포 표면에 고르게 분포합니다. 접시를 37도 섭씨에서 1.5분에서 2.5분 정도 부화시킵니다. 피펫팅으로 세포를 부드럽게 다시 부유시키세요.

트립신을 중화시키기 위해 성장 배지 2밀리리터를 추가하세요. 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브에 옮기고 200G에서 실온에서 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후에는 원심분리관에서 상청액을 버립니다.

세포 펠릿을 1에서 2밀리리터의 배지에 재현탁한 후 자동 계수기로 세포 수를 세기 바랍니다. 다음으로, 8웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 12,000개의 피부섬유세포 또는 20,000개의 케라티노사이트(각각 400마이크로리터 용량)를 씨앗합니다. 씨앗 후 세포를 고르게 분포시키기 위해 방을 교차 흔들어 약 24시간 동안 37도 섭씨에서 배양합니다.

배양 후에는 세포 수합률이 현미경으로 약 80%인지 확인하세요. 배양액이 80% 합류에 도달하면, 세포를 미리 고정하기 위해 챔버 웰에 직접 고정액 몇 방울을 부드럽게 넣습니다. 세포를 상온에서 4분간 배양하여 고정액이 세포를 방해하지 않고 고르게 퍼지도록 합니다.

그 후 우물에서 전고정제를 흡입하고 140마이크로리터의 신선한 고정정액 1을 추가하여 우물 표면을 완전히 덮도록 합니다. 슬라이드를 37도 섭씨에서 15분간 부양하세요. 다음으로, 챔버 웰에서 고정제를 제거하고 100밀리몰라 염화암모늄 140마이크로리터를 첨가하여 잔류 알데히드를 정화합니다.

슬라이드는 실온에서 10분에서 30분 정도 부양하세요. 샘플을 PBS로 세 번 각각 30초간 실온에서 헹구세요. 각 세척 시에는 버퍼를 챔버 벽을 따라 부드럽게 피펫팅하여 세포를 씻어내거나 터널링 나노튜브를 손상시키지 않도록 하세요.

140마이크로리터의 밀 배아 응집형 희석 알렉사 밀가루 접합액을 PBS에서 배양합니다. 실온에서 어두운 환경에서 20분간 배양하여 원형질막 당단백질을 표지하여 막에서 유래한 터널링 나노튜브를 시각화합니다. 그 후 세포를 PBS로 세 번 각각 30초간 세척합니다.

그 후 1%BSA에 1에서 250배로 희석한 140마이크로리터의 팔로이딘 결합액을 실온에서 어두운 곳에서 30분간 배양합니다. 세포를 PBS로 세 번 세척한 후, 140마이크로리터의 DAPI 용액과 함께 실온에서 어두운 환경에서 5분간 배양합니다. 마지막으로, 각 웰에 마운팅 매체를 두세 방울 떨어뜨리고 실온에서 20분간 배양합니다.

슬라이드는 최소 20분 이상 어두운 환경에서 4도 온도에서 보관하다가 영상 촬영을 하세요. 피부 섬유아세포 배양에서는 터널링 나노튜브가 인접 세포를 연결하는 길고 가느다란 돌출부로 관찰되었으며, 밀 생아 응집 및 팔로이딘으로 표지된 F-액틴으로 염색된 막이 있었습니다. 표피 각질혈구 배양에서는 특징적인 F-액틴 양성 돌출부를 가진 터널링 나노튜브가 인접 세포를 연결하는 것도 관찰되었습니다.

피부 섬유아세포와 표피 각질세포의 공동 배양에서, 피부 섬유아세포와 표피 각질세포 사이에 터널링 나노튜브가 일관되게 검출되었으며, 막과 세포 케라틴 5 염색으로 시각화되었습니다. 공동 배양 내 터널링 나노튜브는 F-액틴만 포함된 다양한 세포골격 조직을 보였으며, 섬유, 부분 알파-튜불린이 포함된 F-액틴, 또는 낮은 알파-튜불린 수치를 가진 경우도 모두 포함되었다. 가장 큰 과제는 나노튜브 내에서 터널을 보존하는 것입니다.

이를 위해서는 부드러운 고정, 적절한 타이밍, 그리고 신선하게 준비된 고정 첨가제 사용이 필요합니다. 우리 프로토콜을 사용하면, 터널링 나노튜브의 특성을 다양한 세포 조건에서 측정하여 그 잠재적 기능을 탐구할 수 있습니다. 앞으로는 터널링 나노튜브를 통한 미토콘드리아 전이를 연구하기 위해 형광 표지할 예정입니다.