LncRNA 노크다운 골육종 세포의 증식 능력을 검출하는 콜로니 형성 분석

저의 연구는 골육종에 초점을 맞추고 있으며, 집단 정보 분석을 통해 LncRNA 녹다운이 장기적인 증식 능력에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 것을 목표로 합니다. 우선, 5 곱하기 10의 143B 골육종 세포 5개를 두 개의 10cm 배양 접시에 씨앗 넣습니다. 세포를 완전한 DMEM 배양 상태에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 37도 섭씨의 10% 태아 소 혈청을 보충합니다.

24시간 후 플라스미드, 폴리에틸레니민, 옵티미니엄 필수 매체를 포함한 형질전환 시약을 준비하세요. 각 시약을 소용돌이로 돌려 실온에 평형을 맞춘 후 사용하세요. 이제 마커펜을 사용해 플라스미드와 폴리에틸레니민용 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관 4개를 표시하세요.

각 튜브에 500마이크로리터의 옵티미니엄 필수 배지를 피펫으로 채취하세요. 그 다음 해당 플라스미드 튜브에 플라스미드 10마이크로그램을 추가하고, 각 폴리에틸레니민 튜브에 30마이크로리터의 폴리에틸레니민을 피펫으로 주입합니다. 각 튜브를 위아래로 피펫팅해 부드럽게 섞고 배양하세요.

이제 각 플라스미드 튜브와 해당 폴리에틸레니민 튜브를 결합합니다. 부드럽게 섞은 후 실온에서 20분간 배양하세요. 143B 세포가 포함된 접시에서 배양지를 부드럽게 흡인하세요.

각 접시에 7밀리리터의 세럼 프리 매체를 넣고, 추가할 플라스미드에 따라 접시에 라벨을 붙입니다. 준비된 형질전환 혼합물을 해당 배양 접시에 떨어뜨리듯 추가하세요. 혼합물을 바깥쪽 가장자리에서 접시 중앙 쪽으로 원을 그리며 천천히 넣으세요.

세포를 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양하세요. 상원액은 8시간에서 12시간 후에 버리세요. 그 다음 배양 접시에 완전 DMEM 10밀리리터를 추가하고 배양합니다.

배양지를 교체한 후 72시간 후 형광 현미경으로 세포를 관찰하고, 배양 접시에서 배양지를 제거하세요. 세포를 소화하기 위해 트립신-EDTA 산 1.5밀리리터를 추가하세요. 세포는 부드럽게 피펫을 사용해 세포를 분리합니다.

그 다음 소화를 끝내기 위해 5밀리리터의 완전한 배지를 추가하세요. 세포 현탁액을 15밀리리터 마이크로 원심분리관으로 옮기세요. 그 후 세포 부유액 20마이크로리터를 피펫으로 혈액세포계에 옮겨 세포 수를 세어보세요.

리보핵산 추출을 위해 3 곱하기 10의 5 세포를 수집하여 녹다운 효율을 검증합니다. 이제 웰당 3개의 셀의 제곱 곱하기 2 곱하기 10을 6웰 플레이트에 시드합니다. 피펫으로 DMEM을 완성하여 최종 부피 2밀리리터로 만듭니다.

세포를 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양하세요. 매일 군집 형성을 모니터링하세요. 대조군 대부분의 집락이 최소 50개의 세포를 포함하거나 10일에서 14일 정도 배양 후 배양을 종료하세요.

상청액을 버린 후, 각 웰마다 1밀리리터 PBS로 세포를 두 번 세척하고, 세척 후에는 용액을 버립니다. 세포를 10% 포르말린 용액 1밀리리터에 15분간 고정시킵니다. 고정제는 버리고, PBS 웰당 1밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다.

0.5% 결정 바이올렛 용액 1밀리리터로 세포를 10분에서 30분 동안 염색합니다. 그 후 천천히 흐르는 수돗물로 접시를 부드럽게 씻으세요. 셀을 실온에서 자연 건조시키세요.

카메라로 집단의 이미지를 촬영하세요. 형질전환 후 72시간 후 형광현미경으로 143B 세포의 형질전환 효율이 확인되어, 두 조건 모두에서 효율적인 플라스미드 전달이 가능함을 나타냈다. RT-qPCR 반응 분석 결과, shSNHG6를 형질인화한 143B 세포에서 shNC 그룹에 비해 SNHG6 발현이 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다.

콜로니 형성 분석 결과, SNHG6 녹다운 그룹은 대조군에 비해 콜로니의 수와 크기가 유의미하게 감소했습니다. 이 프로토콜은 단세포 장기 증식을 평가하여 단기 대사 기반 증식 분석보다 더 높은 생물학적 관련성과 더 명확한 결과를 제공합니다. 향후 연구에서는 이 프로토콜을 추가 LncRNA와 종양 모델로 확장하여 암세포 증식 잠재력을 조절하는 메커니즘을 체계적으로 탐구할 예정입니다.