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저자들은 Seurat, Giotto 및 SPOTlight 패키지의 개발자와 관리자들의 지원과 문서화에 감사를 표합니다. 또한 공공 데이터 저장소의 기여와 데이터 세트를 관대하게 공유해 준 연구자들에게도 깊은 감사를 드립니다.

<ol>
	<li>Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.</li>
	<li>Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.</li>
	<li>Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.</li>
	<li>Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933</li>
	<li>Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.</li>
	<li>Chen JG, Ch&#225;vez-Fuentes JC, O&#8217;Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w</li>
	<li>Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.</li>
	<li>Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, Gut I, Heyn H. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes. Nucleic Acids Res. 2021;49(9):e50-e50.</li>
	<li>McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Wills QF. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics. 2017;33(8):1179-1186.</li>
	<li>Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with bioconductor. F1000Research. Preprint posted online October 31, 2016. doi:10.12688/f1000research.9501.2</li>
	<li>Miller BF, Huang F, Atta L, Sahoo A, Fan J. Reference-free cell type deconvolution of multi-cellular pixel-resolution spatially resolved transcriptomics data. Nat Commun. 2022;13(1):2339.</li>
	<li>Palla G, Spitzer H, Klein M, et al. Squidpy: A scalable framework for spatial omics analysis. Nat Methods. 2022;19(2):171-178.</li>
	<li>Luecken MD, B&#252;ttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.</li>
	<li>Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019 Dec 23;20(1):296.</li>
	<li>Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.</li>
	<li>Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.</li>
	<li>Jin S, Plikus MV, Nie Q. CellChat for systematic analysis of cell&#8211;cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 2025;20(1):180-219.</li>
	<li>Zohora FT, Paliwal D, Flores-Figueroa E, et al. CellNEST reveals cell&#8211;cell relay networks using attention mechanisms on spatial transcriptomics. Nat Methods. 2025;22(7):1505-1519.</li>
	<li>Wang Q, Zhu H, Deng L, et al. Spatial transcriptomics: Biotechnologies, computational tools, and neuroscience applications. Small Methods. 2025;9(5):2401107.</li>
	<li>Chen MM, Gao Q, Ning H, et al. Integrated single-cell and spatial transcriptomics uncover distinct cellular subtypes involved in neural invasion in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2025;43(9):1656-1676.e10.</li>
	<li>Li H, Guan W, Huang J, et al. A complete model of mouse embryogenesis through organogenesis enabled by chemically induced embryo founder cells. Cell. 2025;188(21):5912-5930.e20.</li>
	<li>Loh JW, Lee JY, Lim AH, et al. Spatial transcriptomics reveal topological immune landscapes of asian head and neck angiosarcoma. Commun Biol. 2023;6(1):461. </li>
</ol>

저자들은 상충되는 재정적 이해관계가 없음을 밝힙니다.

본 프로토콜은 분석적 깊이와 실질적인 접근성 사이의 균형을 맞춘 공간 전사체 데이터 분석을 위한 종합적인 계산 워크플로우를 제공합니다. 단계별 접근 방식을 통해 초기 데이터 획득부터 고급 공간 분석에 이르는 전체 분석 파이프라인을 연구자에게 안내하며, 중요한 결정 지점과 잠재적인 오류 가능성을 강조합니다.
프로토콜의 여러 단계는 후속 결과에 미치는 영향으로 인해 특별한 주의가 필요합니다. 지나치게 엄격한 필터링은 생물학적으로 유의미한 스팟을 제거할 수 있고, 반대로 완만한 임계값은 기술적 노이즈를 유발할 수 있으므로, 품질 관리 및 필터링 임계값은 특정 조직 유형과 기술 플랫폼에 맞게 세심하게 조정해야 합니다. 정규화 방법의 선택은 후속 클러스터링 및 차등 발현 결과에 상당한 영향을 미칩니다. 예를 들어, 본 파이프라인은 표준 로그 정규화 대신 SCTransform을 사용하는데, 이는 SCTransform이 단일 세포 및 공간 워크플로우에서 시퀀싱 깊이 및 기타 기술적 효과와 관련된 기술적 변동을 모델링하고 감소시키는 것으로 보고되었기 때문입니다14,15. 통합 과정에서 통합 특성과 해상도 매개변수의 선택은 통합 강도와 생물학적 신호의 보존 사이의 균형을 맞추기 위해 신중한 고려가 필요합니다. 공간적 가변 유전자 검출의 경우, 계산 확장성과 어레이 기반 데이터의 공간적 자기상관 분석에 대한 적합성 때문에 Moran's I가 선택되었으나, 데이터셋 크기와 연구 목적에 따라 SPARK와 같은 대안적인 검출 도구를 고려할 수 있습니다16.
이 워크플로의 문제 해결 구성 요소는 한 패키지에서 다음 패키지로 출력을 전달할 때 발생하는 일반적인 상호 운용성 문제에 초점을 맞춥니다. 단일한 일반 변환 단계에 의존하는 대신, 이 워크플로는 각 소프트웨어 인터페이스에서 맞춤형 형식 변환을 사용합니다: 공간 카운트 데이터는 Seurat 통합 전에 표준 RNA assay 슬롯으로 복사됩니다. Seurat 및 단일 세포 참조 객체는 SPOTlight를 위해 SingleCellExperiment 객체로 변환됩니다. 공간 카운트 행렬은 STdeconvolve에 맞게 형식이 재구성됩니다. Seurat 유래 카운트, 좌표 및 세포 유형 메타데이터는 세포 간 통신 분석을 위해 Giotto 객체로 변환됩니다. Select Spatial Spots의 ROI 주석은 Seurat 객체로 다시 매핑할 수 있도록 CELL_ID, X/Y 좌표 및 그룹 라벨이 포함된 CSV 파일로 내보내집니다. 이러한 단계는 사용자가 호환되지 않는 assay 슬롯, 일치하지 않는 스팟 식별자, 누락된 메타데이터 열, 잘못된 좌표 형식 및 리간드-수용체 유전자 기호 불일치와 같은 일반적인 문제를 식별하고 수정하는 데 도움을 줍니다.
이 워크플로의 추가적인 특징은 단일 알고리즘에 의존하지 않고 두 가지 상호 보완적인 디콘볼루션(deconvolution) 전략을 사용한다는 점입니다. SPOTlight는 참조 기반의 세포 유형 비율 추정을 위해 기존 scRNA-seq 참조 데이터를 사용하는 반면, STdeconvolve는 참조 데이터 없이 잠재적인 전사 토픽(transcriptional topics)을 발견할 수 있게 합니다. 시연 데이터셋에서 STdeconvolve 토픽은 조직학적으로 정의된 영역과 일치하여(그림 5B), 생물학적 해석 가능성을 뒷받침했습니다. 본 프로토콜에서는 두 방법 간의 직접적인 정량적 비교를 수행하지 않았으며, 자신의 데이터로 이를 벤치마킹하고자 하는 사용자는 프로토콜 단계 7.3.2에서 제공하는 프레임워크를 따르면 됩니다. 또한, 본 프로토콜은 핵심 기능에는 스크립트를 사용하고 직관적인 ROI 분리를 위해 그래픽 인터페이스(Select Spatial Spots)를 제공함으로써 사용 편의성과 추적 가능성을 지원합니다.
Seurat과 Giotto를 연동하면 Seurat 기반의 전처리 및 통합과 Giotto 기반의 공간 통계 및 네트워크 분석을 결합한 워크플로우를 구축할 수 있습니다. Seurat은 scRNA-seq 경험이 있는 연구자들에게 익숙한 환경을 제공하며 다중 샘플 통합을 지원하는 반면, 조화된 데이터를 Giotto로 전송하면 공간 네트워크 구축과 리간드-수용체 분석이 가능해집니다. 이러한 설계는 사용자가 두 플랫폼의 입증된 강점을 모두 활용할 수 있도록 하며, 이것이 Squidpy나 다른 프레임워크와 비교하여 벤치마킹되었음을 의미하는 것은 아닙니다. 세포 간 통신 분석의 경우, 동일한 분석 환경 내에서 공간적 인접성을 통합하는 Giotto의 Delaunay 네트워크 기반 리간드-수용체 추론 방법을 사용하였습니다. CellChat과 같은 프레임워크는 광범위한 신호 전달 데이터베이스를 제공하지만, 본 프로토콜에서는 평가하지 않았습니다17.
몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 참조 기반 디콘볼루션(deconvolution) 방식은 고품질의 일치하는 단일 세포 참조 데이터의 가용성에 결정적으로 의존합니다. 또한, 세포 간 통신 분석의 기본 가정은 전사체 공동 발현을 물리적 단백질 상호작용의 대리 지표로 사용하는 것이므로, 이후의 실험적 검증이 필요합니다. 마지막으로, 본 워크플로우는 주로 표준 Visium 데이터셋을 중심으로 개발되었습니다. Visium HD와 같은 단일 세포에 가까운 해상도 기술로 분야가 발전함에 따라 분석적 고려 사항이 변경될 것입니다. 더 높은 해상도의 데이터는 서로 다른 전처리 파라미터를 필요로 할 수 있으며, 스팟 디콘볼루션의 절대적인 필요성을 줄일 수 있습니다. 이 워크플로우를 Visium HD 데이터셋에 적용하려면, 고해상도 빈(bin)을 컴퓨터 연산을 통해 더 큰 공간 빈으로 집계하거나, 스팟 디콘볼루션 모듈을 생략하고 이미지 기반 세포 분할(cell segmentation) 방식을 사용할 수 있습니다18.
이러한 특징들은 발생 생물학, 신경 과학, 암 연구 및 면역학을 포함한 다양한 생물학적 분야로의 잠재적 적용 가능성을 시사합니다19,20,21,22. 모듈식 설계를 통해 연구자는 공간적 도메인 식별, 세포 간 통신 또는 지역적 특성화 중 연구 목적에 따라 특정 구성 요소를 맞춤형으로 조정하여 사용할 수 있습니다. 공간 기술이 지속적으로 발전하고 데이터 세트가 확장됨에 따라, 본 프로토콜은 새로운 분석 방법을 통합하고 새롭게 제기되는 생물학적 질문을 해결하기 위해 확장 가능한 기반을 제공합니다.

공간 전사체학(Spatial transcriptomics, ST)은 조직 절편 내 메신저 RNA(mRNA) 분자의 공간적 좌표를 유지하면서 게놈 전반의 유전자 발현을 측정하는 혁신적인 기술군입니다. ST 방법에는 위치 바코드가 지정된 어레이를 사용하는 시퀀싱 기반 접근법과 온전한 조직 미세환경 내에서 전사 신호를 매핑하는 in situ 이미징 접근법이 포함됩니다1,2. ST는 공간적 맥락을 보존함으로써, 조직 해리 후에는 완전히 분석할 수 없는 조직 구조, 세포 인접 조직 구성, 세포 간 통신 및 미세환경 관련 생물학적 과정의 분석을 가능하게 합니다3.
공공 ST 데이터 저장소의 급격한 성장은 2차 분석 및 방법론 개발에 전례 없는 기회를 제공해 왔습니다3. CROST 데이터베이스와 같은 리소스는 다양한 종과 기술 플랫폼에 걸쳐 수백 개의 공간 분해 전사체 데이터셋을 큐레이션하며, STOmicsDB와 같은 전문 컬렉션은 Stereo-seq와 같은 특정 방법론에 집중합니다4,5. 이러한 데이터의 풍부함에도 불구하고, 공간 데이터 구조의 복잡성, 분석 도구의 다양성, 그리고 재현 가능한 워크플로 구현의 기술적 장애물로 인해 계산 분석은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다6,7,8,9,10,11.
단일 소프트웨어 환경에 의존하는 한계를 해결하기 위해, 상호 보완적인 분석 도구를 활용하는 통합 계산 워크플로우를 본 논문에서 제시한다. 기존의 종합적인 ST 분석 생태계에는 주로 Seurat, Giotto 및 Squidpy6,7,12와 같은 Python 기반 프레임워크가 포함된다. Squidpy와 같은 Python 기반 도구는 공간 그래프 분석을 위한 광범위한 기능을 제공하지만, 주요 계산 파이프라인을 단일 프로그래밍 언어 환경 내로 통합하면 언어 간의 기술적 장벽을 최소화할 수 있다. 따라서 언어 간 기술적 장벽을 줄이기 위해 핵심 파이프라인은 주로 R로 구현되었다. 이 R 기반 워크플로우 내에서 Seurat은 데이터 로딩, 품질 관리, 정규화, 차원 축소, 시각화 및 다중 샘플 통합에 사용되며, 이는 단일 세포 및 공간 전사체 워크플로우에서 Seurat이 보편적으로 사용되는 것을 반영한다. 이후 Giotto는 공간 네트워크 구축 및 리간드-수용체 기반의 세포 간 통신 분석에 사용된다. 결과적으로 이 파이프라인은 Seurat 기반의 전처리와 통합을 Giotto 기반의 공간 분석과 연결하며, 두 도구 세트 간의 데이터 전송을 명시적이고 재현 가능하게 유지한다.
이 프레임워크 내에서는 두 가지 상호 보완적인 디컨볼루션(deconvolution) 전략이 구현되어 있습니다. 하나는 scRNA-seq 데이터를 사용하여 세포 유형 비율을 추정하는 참조 가이드 방식인 SPOTlight이며, 다른 하나는 잠재적인 전사 패턴을 식별하는 비지도 학습 기반의 토픽 모델링 방식인 STdeconvolve8,11입니다. 출력 결과는 공간적 세포 이질성에 대한 상호 보완적인 관점을 제공하지만, 사용자가 프로토콜에 기술된 선택적 일치도 분석(concordance analysis)을 수행하지 않는 한 이를 정량적인 교차 검증으로 처리하지 않습니다. 상호작용형 관심 영역(ROI) 주석 달기를 위해 맞춤형 Python Dash 애플리케이션인 Select Spatial Spots가 통합되어 있으며, 이후의 다운스트림 분석에 사용할 수 있는 표준 좌표 기반 주석 파일을 내보냅니다.
실질적인 적용 가능성과 관련하여, 본 워크플로우는 주로 표준 어레이 기반 ST 데이터(예: 55 µm 해상도의 Visium)를 위해 설계되었으며, 파라미터 평가 후 다른 조직 유형에도 적용 가능할 수 있습니다. 분석 전 몇 가지 주요 제한 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 참조 가이드 디컨볼루션(reference-guided deconvolution) 모듈은 고품질의 조직 일치 scRNA-seq 참조 데이터에 의존합니다. 둘째, 세포 하위 수준 또는 단일 세포에 가까운 플랫폼의 경우, 통합 전 전처리, 공간 빈 집계(spatial bin aggregation) 또는 이미지 기반 세포 분할의 수정이 필요할 수 있습니다2. 대표적인 마우스 결장 데이터셋은 보편적인 플랫폼 호환성의 증거가 아니라, 본 워크플로우가 공간 도메인 및 마커 정의 조직 구조를 어떻게 평가할 수 있는지 보여주기 위한 시연 사례로 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>ggplot2</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v4.0.0(CRAN)</td><td>고급 데이터 시각화</td></tr><tr><td>Giotto</td><td>Dries Lab</td><td>v4.2.2 (GitHub)</td><td>공간 네트워크 및 세포-세포 간 통신 분석</td></tr><tr><td>patchwork&amp;nbsp;</td><td>Thomas Lin Pedersen</td><td>v1.3.2 (CRAN)</td><td>플롯 구성 및 배치</td></tr><tr><td>R software&amp;nbsp;</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>v4.4.3</td><td>핵심 실행 환경 (macOS aarch64)</td></tr><tr><td>scater</td><td>Davis McCarthy et al.</td><td>v1.34.1 (Bioconductor)</td><td>단일 세포 품질 관리 및 시각화</td></tr><tr><td>scran</td><td>Aaron Lun et al.</td><td>v1.34.0 (Bioconductor)</td><td>단일 세포 분산 모델링 및 마커 검출</td></tr><tr><td>Select Spatial Spots (사용자 정의 Python 도구)</td><td>LeafLight</td><td>v1.0.0 (GitHub)</td><td>대화형 공간 관심 영역(ROI) 선택 (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)</td></tr><tr><td>Seurat&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.3.0 (CRAN)</td><td>공간 데이터 전처리, 통합 및 클러스터링</td></tr><tr><td>SeuratObject&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.2.0 (CRAN)</td><td>단일 세포 및 공간 데이터를 위한 데이터 구조</td></tr><tr><td>SingleCellExperiment</td><td>Bioconductor Core Team</td><td>v1.28.1 (Bioconductor)</td><td>scRNA-seq를 위한 표준화된 데이터 컨테이너</td></tr><tr><td>SPOTlight</td><td>Marc Elosua-Bayes et al.</td><td>v1.10.0 (Bioconductor)</td><td>참조 가이드 기반 공간 디컨볼루션</td></tr><tr><td>Stdeconvolve</td><td>Jean Fan Lab</td><td>v1.3.2 (Bioconductor)</td><td>비지도 잠재 토픽 모델링</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v2.0.0 (CRAN)</td><td>핵심 데이터 조작 및 포맷팅 스위트</td></tr></tbody></table>

공간 전사체 데이터 분석을 위한 실무 워크플로우: 데이터 획득부터 심층 분석까지

A Practical Workflow for Spatial Transcriptomics Data Analysis: From Data Acquisition to Advanced Analyses

공간 전사체학(Spatial transcriptomics, ST)은 조직 절편 내 mRNA 분자의 2차원적 공간 문맥을 유지하면서 전유전체 수준의 유전자 발현을 프로파일링하여, 조직 구조 및 미세환경 관련 생물학 연구를 가능하게 합니다. 그러나 데이터 가져오기, 품질 관리, 통합, 디콘볼루션(deconvolution), 공간 통계 및 시각화 과정에서 종종 여러 소프트웨어 환경과 재현 가능한 파라미터 선택이 필요하기 때문에 ST 분석은 여전히 까다로운 과제로 남아 있습니다. 본 프로토콜은 R을 이용한 공개 ST 데이터셋의 실용적인 계산 워크플로우를 제시하며, 데이터 획득 및 소프트웨어 설정부터 시작하여 Seurat 기반의 데이터 로딩, 품질 관리, 정규화, 다중 샘플 통합, 클러스터링 및 공간 가변 유전자 분석으로 이어집니다. 이후 워크플로우는 참조 가이드형 SPOTlight 분석 및 비지도 학습 기반 STdeconvolve 토픽 모델링을 포함한 상호 보완적인 디콘볼루션 전략을 적용하며, 이어서 Giotto 기반의 공간적 세포 간 통신 분석과 맞춤형 Python Dash 애플리케이션을 이용한 인터랙티브 관심 영역(ROI) 선택을 수행합니다. 스크립트 기반 실행, 명시적인 파라미터 근거, 예상 결과 및 문제 해결 체크포인트를 강조함으로써, 본 프로토콜은 데이터셋 및 플랫폼별 파라미터 평가 후 표준 어레이 기반 ST 데이터셋 및 관련 플랫폼에 적용 가능한 유연한 프레임워크를 제공합니다.

워크플로우 구현 및 데이터 통합을 통한 주요 조직 특성 분석
마우스 결장 공간 전사체 데이터에 계산 워크플로우를 적용하여 분석 단계별 예상 결과물을 예시하였다. 워크플로우 도식(그림 1)에 나타낸 바와 같이, 파이프라인은 데이터 획득 및 품질 관리로 시작되었으며, 여기서 공간 특성 플롯을 통해 조직 경계를 정의하였다(그림 2A,B). 이후 해석 가능한 생물학적 변이를 보존하면서 기술적인 배치 효과를 줄이기 위해 Seurat의 앵커 기반 통합 워크플로우를 사용하였다. UMAP 시각화를 통해 통합 후의 샘플 정렬 및 공간 클러스터링 패턴을 확인하였다(그림 2C,D). 차원 축소 및 후속 클러스터링을 안내하기 위해 누적 분산을 기반으로 주성분(PC)을 정량적이고 동적으로 선택하는 방식을 구현하였다(보충 그림 1 참조). 마커 유전자 히트맵 분석을 통해 공간 클러스터의 기초가 되는 뚜렷한 전사 프로파일을 확인하였다(그림 2E).
계산 클러스터가 알려진 결장 조직학의 해부학적 구조와 일치하는지 평가하기 위해, 전형적인 층 특이적 마커 유전자의 발현 프로파일을 분석하였습니다. 점막 상피층에서는 Epcam 및 Krt8을 포함한 상피세포 마커와 함께 술잔세포 마커인 Muc2의 발현이 나타났습니다. Col1a1 및 Vim과 같은 중간엽 및 기질 마커는 고유층과 점막하층 영역을 표시하였으며, 가장 바깥쪽의 근육층은 Acta2 및 Tagln과 같은 평활근 구조 유전자에 의해 확인되었습니다. 이러한 계통 관련 마커들의 공간적 제한성은 통합 및 클러스터링 워크플로우가 점막에서 근육층으로 이어지는 축을 따라 결장 조직의 주요 조직학적 층판 구조를 보존했다는 해석을 뒷받침합니다(부록 그림 2 참조).
클러스터 검증 후, 실험 조건 간의 차별 발현 유전자(DEG)를 식별하기 위해 하위 차별 발현 분석을 수행하였습니다(그림 2F,G). 또한, Moran's I 통계량을 사용하여 공간적 가변 유전자를 식별함으로써, 조직 전체에서 유의미한 비무작위적 공간 분포를 보이는 유전자들을 강조하였습니다(그림 2H).
세포 디콘볼루션 및 공간 상호작용 네트워크를 통한 조직 미세구조 분석
단일 세포 RNA-seq 참조 데이터를 처리하여 QC 필터링(그림 3A), 비지도 클러스터링(그림 3B), 마커 유전자 검증(그림 3C), 그리고 독립적인 주석과의 일치성(그림 3D)을 통해 뒷받침되는 주석을 도출하였습니다. 세포 구성(그림 3E)은 디컨볼루션(deconvolution)을 위한 다운샘플링 전략의 근거가 되었습니다. SPOTlight는 공간적 스팟 전반에 걸쳐 참조 가이드 기반의 세포 유형 비율을 추정하였으며(그림 4A,B), 반면 STdeconvolve는 공간적 세포 패턴에 대한 비지도 토픽 모델링 관점을 제공하였습니다(그림 5B). 사용자 정의 Select Spatial Spots 도구를 통해 이러한 패턴에 대한 조직학적 맥락을 확인하였습니다(그림 5A). 마지막으로, 디컨볼루션된 세포 유형 할당을 사용하여 공간 통신 분석을 수행함으로써 공간적으로 인접한 세포 유형 그룹 간의 리간드-수용체 상호작용을 식별하였습니다(그림 6A,B).
프로토콜 최적화를 통해 얻은 문제 해결 관찰 사항
프로토콜 최적화 과정에서 실질적인 체크포인트의 근거가 되는 몇 가지 문제점이 확인되었습니다. 단일 세포 참조 데이터가 조직 문맥과 제대로 일치하지 않을 때 디콘볼루션(deconvolution) 결과가 최적화되지 않았으며, 이는 가능한 경우 조직 및 종이 일치하는 scRNA-seq 데이터를 사용해야 함을 시사합니다. 기본 파라미터를 이용한 초기 클러스터링 시도에서 예상되는 생물학적 구조가 항상 명확히 분리되지는 않았습니다. PC 선택, 클러스터링 해상도 및 마커 유전자의 일관성을 검토함으로써 조직 해부학적 구조와 일치하고 공간적으로 해석 가능한 도메인을 식별하는 데 도움이 되었습니다. 이러한 관찰 결과는 사용자가 워크플로 실행 중에 흔히 발생하는 분석 문제를 진단하는 방법에 대한 실질적인 사례를 제공합니다.
<img alt="scRNA-seq 데이터 분석 워크플로우 다이어그램. 프로세스: 정규화, 통합, 클러스터링." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 1"> 
그림 1통합 공간 전사체 분석 워크플로우. 데이터 획득 및 전처리를 거쳐 고급 공간 분석에 이르는 분석 파이프라인의 모식도. 주요 단계는 다음과 같다: (1) Seurat을 이용한 데이터 로딩, 품질 관리 및 다중 샘플 통합; (2) 공간 클러스터링 및 공간 가변 유전자 검출; (3) 세포 유형 디컨볼루션(deconvolution) ~을 통해 / ~을 경유하여 참조 기반(SPOTlight) 및 비지도(STdeconvolve) 방법; (4) Giotto를 이용한 공간적 세포 간 통신 분석 및 맞춤형 도구를 이용한 대화형 관심 영역 선택, 공간적 스팟 선택모든 모듈의 결과가 종합되어 조직 구조와 세포 미세환경에 대한 생물학적 통찰을 도출합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="바이올린 플롯, t-SNE 클러스터링, 볼케이노 플롯 및 히트맵 데이터를 이용한 공간 전사체 분석" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 2"> 
그림 2데이터 통합, 클러스터링 및 차등 발현 분석. (A, B) 공간 샘플 A1 및 B1에 대한 품질 관리 지표로, 유전자 수, UMI 수 및 미토콘드리아 유전자 백분율의 분포를 보여준다. (C샘플 기원(왼쪽) 및 클러스터링 정체성(오른쪽)으로 색상 구분된 통합 공간 전사체 데이터의 UMAP 시각화.D조직 절편 상의 클러스터 정체성 공간 투영.E) 각 공간 클러스터별 상위 마커 유전자의 히트맵. (F) A1_colon_d0와 B1_colon_d14 조건 간의 차등 발현 유전자를 나타내는 볼케이노 플롯. (G) 조직 절편 전반에 걸친 대표적 차등 발현 유전자의 공간적 발현 패턴. (H식별된 상위 공간 가변 유전자들의 공간적 발현 지도 ~을 통해 Moran's I 통계량으로, 왼쪽 두 패널은 A1_colon_d0 샘플의 유전자를, 오른쪽 두 패널은 B1_colon_d14 샘플의 유전자를 나타냄. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="scRNA-seq 분석: 바이올린 플롯, UMAP 클러스터, 세포 유형 점수 및 막대 그래프 분포." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 3"> 
그림 3단일 세포 참조 데이터 처리 및 주석 달기. (A) 필터링 전후 scRNA-seq 참조 데이터의 품질 관리 지표. (B) 비지도 클러스터별로 색상을 지정한 scRNA-seq 데이터의 UMAP 시각화. (C) 클러스터별 표준 세포 유형 마커 유전자의 발현 점수를 나타내는 도트 플롯. (D) 주요 세포 유형이 표시된 scRNA-seq 데이터의 주석 처리된 UMAP 시각화. (E) scRNA-seq 참조 데이터셋의 세포 구성. 빨간색 점선은 계산 효율성과 세포 유형 표현의 균형을 맞추기 위해 SPOTlight 디컨볼루션(deconvolution) 과정 중 적용된 다운샘플링 임계값(유형당 n = 50개 세포)을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="세포 유형 분포, 현미경 이미지; 조직 내 B 세포, 내피세포, 섬유아세포 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 4"> 
그림 4세포 이질성의 공간적 디컨볼루션. (A, BSPOTlight 디콘볼루션(deconvolution)을 통해 도출된 공간 산점파이 도표(spatial scatterpie plots)로, 샘플 A1의 각 스폿(spot)별 주요 세포 유형의 비율 구성을 보여준다.A) 및 B1 (B). (C) 시료 A1(왼쪽)과 B1(오른쪽)에서 B 세포의 대표적인 공간적 분포로, 디콘볼루션(deconvolution)을 통해 식별된 특정 면역 세포 집단의 공간 분해 국소화 패턴을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="공간 유전자 발현 분석, 조직 절편 내 세포 유형과 픽셀 그룹을 보여주는 도식." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 5"> 
그림 5대화형 관심 영역 분석 및 비지도 디컨볼루션 비교. (A( ) 근위 결장, 원위 결장 및 기타 조직 영역에 해당하는 부위를 대화형으로 선택하는 모습을 보여주는 맞춤형 "공간 스폿 선택(Select Spatial Spots)" 도구의 인터페이스. ( )B( 샘플 A1에 대한 비지도 디컨볼루션 결과(STdeconvolve)의 공간적 scatterpie 시각화로, ( 의 수동 주석 지정 영역에 따라 스팟별로 색상을 표시함)A), 조직학 기반의 어노테이션과 계산적으로 도출된 세포 토픽 분포 사이의 대응 관계를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="리간드-수용체 상호작용 및 log2fc 값이 포함된 세포 간 통신 도표; 버블 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 6"> 
그림 6공간 정보 기반의 세포 간 통신 네트워크. (A, B) Giotto를 통해 추론된 샘플 A1의 리간드-수용체 상호작용 네트워크 (A) 및 B1 (B). 노드는 세포 유형을 나타내며, 엣지는 유의미한 리간드-수용체 쌍(FDR &lt; 0.05), 그리고 엣지 두께는 상호작용 강도를 나타냅니다. 비교 가능성과 시각적 명확성을 확보하기 위해, 일관된 유의성 임계값(FDR &lt; 모든 샘플에 대해 (p < 0.05)가 적용되었으며, 각 조건별로 log2FC 순위가 가장 높은 상위 20개 상호작용이 표시되었습니다. 네트워크는 결장 조직의 공간적 맥락 내에서 세포 유형 특이적 통신 패턴을 강조하여 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
부록 그림 1: 차원 축소를 위한 파라미터 최적화의 정량적 평가. 엘보우 플롯(elbow plot)은 주성분(PC)의 최적 개수를 동적으로 선택하는 워크플로의 프로그램적 접근 방식을 보여줍니다. 선택 과정은 누적 표준 편차와 한계 분산 임계값을 기준으로 계산되며, 이는 빨간색 수직선으로 표시됩니다. 이는 후속 클러스터링 단계에 앞서 기술적 노이즈를 완화하는 동시에 생물학적 분산을 포착하기 위함입니다.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS1.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
부록 그림 2: 표준 결장 층 특이적 마커를 이용한 공간적 클러스터링 검증. (A) 계산 클러스터 전반에 걸쳐 상피, 기질 및 평활근 마커의 농축된 발현을 보여주는 도트 플롯. (B) 대표 마커(Epcam, Col1a1, Acta2)를 조직 좌표에 다시 매핑한 공간적 특성 플롯.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS2.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 프로토콜은 공간 전사체 데이터 분석을 위한 재현 가능한 워크플로우를 제시하며, 공개 데이터 획득 및 Seurat 기반의 품질 관리부터 통합, 공간적 특징 검출, 세포 유형 디콘볼루션(deconvolution), 관심 영역 주석 달기, 그리고 세포 간 통신 분석에 이르기까지의 과정을 안내하며, 투명한 실행을 지원하는 실질적인 체크포인트를 제공합니다.

공간 전사체학(Spatial transcriptomics, ST)은 조직 내 mRNA 분자의 2차원적 공간 맥락을 유지하면서 전장 유전체 수준의 유전자 발현을 분석합니다...

안녕하세요. 본 영상에서는 데이터 획득 및 로딩부터 기초 탐색, 그리고 최종적인 심층 분석에 이르기까지의 실무적인 공간 전사체 데이터 분석 파이프라인을 살펴보겠습니다. 전반적인 워크플로우는 세 가지 주요 단계로 구성됩니다.첫째, 데이터를 다운로드하고, 둘째, 분석 코드를 확보하며, 셋째, 파이프라인을 실행하여 결과를 생성합니다. 1단계는 데이터 획득 및 디렉토리 구조 준비입니다. 우선, 공개 공간 전사체 데이터 세트를 확보하십시오.원시 데이터 아카이브를 다운로드하십시오. 그리고 아카이브를 압축 해제하십시오. 파일들을 표준화된 디렉토리 구조로 정리하십시오.먼저 메인 데이터 디렉토리를 생성한 다음, 각 샘플을 위한 전용 하위 디렉토리를 생성하십시오. 각 샘플에 해당하는 필수 파일들을 해당 하위 디렉토리로 전송하십시오. 그런 다음 각 샘플 디렉토리 내에 spatial 하위 폴더를 생성하십시오.다음 파일들을 spatial 하위 폴더에 넣습니다. 필터링된 feature PC metrics S1 파일을 샘플의 메인 하위 디렉토리에 넣습니다. spatial 폴더 내의 gzip 파일들을 압축 해제합니다.파일 이름이 load 10X spatial 함수에서 요구하는 형식과 정확히 일치하는지 확인하십시오. 두 번째 단계는 소프트웨어 환경 설정입니다. 여기서는 R 언어 설치 과정은 생략하며, GitHub 저장소에서 분석 스크립트를 가져오는 것부터 데이터 처리를 시작합니다.setup R 스크립트를 실행하여 conductor 파일에 있는 Graham의 필수 R 패키지를 설치하십시오. 공식 문서 시트에 제공된 설치 명령어를 실행하여 auto suit를 설치하십시오. 공식 설치 URL로 이동하여 설정 스크립트를 가져오십시오. 설정 페이지의 지침에 따라 필요한 Python 환경 및 시스템 종속성을 초기화하십시오.GitHub 리포지토리에 접속하여 커스텀 툴을 확보하고 소스 코드를 다운로드합니다. TOS 디렉토리로 이동하여 Python 종속성을 설치합니다. 세 번째 단계는 공간 데이터 로딩 및 품질 관리입니다.공간 데이터를 Seurat 객체로 읽어들입니다. read 10X image를 사용하여 고해상도 조직 이미지를 수동으로 로드합니다. 이때 이미지 경로와 이미지 이름을 지정합니다.이전 단계에서 생성한 이미지 객체를 image 파라미터로 설정하여 load 10X spatial을 사용하고 Seurat 객체를 생성합니다. 품질 관리 지표를 계산합니다. pattern을 mt로 설정한 percentage feature set을 사용하여 미토콘드리아 리드 비율을 계산합니다.QC 메트릭을 기반으로 데이터를 시각화하고 해석하십시오. violin plot 함수를 사용하여 nCount_Spatial, nFeature_Spatial 및 percent.mt의 바이올린 플롯을 생성하십시오.공간 특징 플롯을 사용하여 이러한 메트릭의 공간 특징 플롯을 생성하십시오. 그리고 조직 영역 외부에 있는 스팟을 식별하십시오. 선택 사항으로, 품질이 낮은 스팟을 제거하기 위해 필터를 적용하십시오.스크립트를 실행하면 QC 지표와 특성 공간 도표를 포함한 이러한 결과들을 얻을 수 있습니다. 4단계는 데이터 전처리, 통합 및 클러스터링입니다. 개별 샘플의 전처리 과정에서 정규화를 수행합니다.Spatial 분석 어세이를 사용하여 각 샘플에 개별적으로 SC transform 정규화를 적용하십시오. 여러 샘플을 통합하십시오. 통합을 위해 SCTransform 정규화된 객체 목록을 준비하십시오.공간 분석(spatial assay)을 복사하여 각 객체에 RNA 분석(RNA assay)이 포함되도록 합니다. PREP SCT 통합(integration)의 선택적 통합 기능(select integration features)을 사용하여 공유 가변 특성(shared variable features)을 식별합니다. 정규화 방법으로 SCT를 사용하는 find integration anchors를 통해 통합 앵커(integration anchors)를 찾습니다.IntegrateData를 사용하여 데이터를 통합하십시오. 통합된 assay에 대해 클러스터링 및 차원 축소를 수행하십시오. runPCA를 사용하여 통합된 데이터에 대해 PCA를 실행하십시오.누적 설명 분산을 계산하여 다운스트림 분석을 위한 최적의 주성분 개수를 결정합니다. 엘보우 포인트(elbow point)를 프로그램으로 식별합니다. 결정된 PC 개수를 사용하여 UMap을 실행합니다.FindNeighbors와 FindClusters를 사용하여 세포를 클러스터링합니다. 설정된 resolution 0.5에서 결정된 PC들을 지정하십시오. FindWorkers 함수를 사용하여 표적 그룹 간의 차등 발현 분석을 수행합니다.공간적 가변 유전자를 식별합니다. 각 원본 샘플에 대해, SCT assay에서 Moran's I 방법을 이용한 find spatially variable features를 실행하여 공간적 자기상관을 계산합니다. 이 스크립트를 실행한 후, 엘보우 플롯, UMap 플롯, 클러스터 플롯, 클러스터 마커 히트맵, 화산 플롯, 공간적 특징 차별 발현 유전자, 공간적 신뢰 유전자 및 결장 층 마커를 얻을 수 있습니다.그리고 결장 층 마커 도트 플롯과 공간 특징 플롯의 마커들을 확인합니다. 5단계, 단일 세포 참조 데이터 전처리 단계입니다. read 10X를 사용하여 단일 세포 RNA-seq 카운트 행렬을 읽고, Seurat 객체를 생성합니다.표준 QC 정규화 및 디클러스터링(declustering)을 수행합니다. 필터링된 세포 내 미토콘드리아 리드의 백분율을 계산합니다. SC transform을 사용하여 데이터를 정규화합니다.vara.to.를 설정하고 percent.mt.를 회귀 분석합니다. Long PCA UMap을 수행하고 이전 단계에서 설명한 동적 PC 선택 방법을 사용하여 세포를 클러스터링한 다음, 세포 유형을 주석 처리합니다.AddModuleScore를 사용하여 표준 세포 유형 마커 유전자에 대한 모듈 점수를 계산합니다. 모듈 점수와 알려진 생물학적 지식을 바탕으로 클러스터를 주석 처리합니다. 또는 메타데이터에서 미리 계산된 주석을 가져올 수 있습니다.이 스크립트를 학습한 후, QC 지표를 얻을 수 있습니다. 클러스터별 UMap, 샘플별 UMap, 세포 유형 점수가 업로드되어 있습니다. 6단계는 SPOTlight를 이용한 참조 가이드 디콘볼루션(reference guided deconvolution)입니다.먼저, SPOTlight를 위한 데이터를 준비합니다. 주석이 달린 단일 세포 Seurat 객체와 공간 Seurat 객체를 단일 세포 실험 객체(single-cell experiment object)로 변환합니다. LogMoreCounts를 사용하여 단일 세포 데이터를 로그 정규화합니다.그런 다음 SPOTlight 디콘볼루션을 실행합니다. 우선, ModelGeneVar를 사용하여 단일 세포 데이터에서 고변이 유전자를 식별합니다. 스코어 마커를 사용하여 세포 유형 마커를 계산하고 고품질 마커만 필터링합니다.계산 시간을 단축하기 위해 각 세포 유형별 단일 세포 참조 데이터를 관리 가능한 수준으로 다운샘플링합니다. 단일 세포 참조 데이터, 공간 데이터, 마커 목록 및 HVG를 제공하여 SPOTlight 함수를 통해 디콘볼루션을 수행한 후, 그 결과를 시각화하고 내보낼 수 있습니다. 다음과 같이 산점도 파이프 경로로 표시된 디콘볼루션 결과를 얻을 수 있습니다.7단계, Stdeconvolve를 이용한 비지도 디컨볼루션입니다. 먼저, 공간 데이터를 준비합니다. GetAssayData의 slot counts를 사용하여 공간 Seurat 객체에서 행 카운트 메트릭을 추출합니다.STdeconvolve에서 얻은 정제된 카운트(clean counts)를 사용하여 품질이 낮은 스폿(spot)과 유전자를 제거합니다. restrict strict LDA를 통해 코퍼스 내의 4개 유전자가 최소 스폿 분율에서 발현되는 필터의 잠재적 세포 유형을 식별하며, fitLDA를 사용하여 다양한 잠재적 토픽 수 범위에 걸쳐 해당 할당 모델을 도출합니다. opt min을 이용한 최적 모델(optimal model)을 통해 복잡성이 최소화되는 지점을 기준으로 최적의 모델을 선택합니다.결과를 분석하고 시각화하십시오. getBetaTheta를 사용하여 최적 모델의 혈청형 비율(Theta)과 유전자 프로파일(Beta)을 추출하십시오. 부식 주제에 대한 생물학적 해석을 추가하려면, select spatial spot 도구로 생성한 관심 영역(region of interest) 주석을 가져오십시오.이 어노테이션을 모든 토픽(with all topics) 기능의 그룹 파라미터로 사용하십시오. 디콘볼루션된 세포 유형 비율을 프로젝트의 공간 좌표에 다시 매핑하고, 각 스팟을 ROI별로 색상 코딩하십시오. 스크립트를 실행하면 SPOTlight에서 생성된 것과 같이 스케일 파이프 로드 형태의 결과를 얻게 됩니다.8단계, Giotto를 이용한 공간적 세포 간 통신 분석입니다. 먼저, Seurat 객체를 Giotto 객체로 변환합니다. createGiottoObject 함수를 사용하여 low-count metrics와 공간 좌표를 제공하십시오.Giotto 객체를 전처리하고 디컨볼루션(deconvolution) 결과를 추가합니다. normalized Giotto를 사용하여 데이터를 정규화하고, 이를 혈청형(serotype) 주석으로 추가합니다. addCellmetadata를 사용하여 세포 메타데이터를 선택합니다.createSpatialNetwork를 사용하여 공간 네트워크를 생성하십시오. 리간드-수용체 데이터베이스를 환경으로 로드하십시오. explore CellCellcom을 실행하여 공간적으로 인접한 세포 유형 간의 유의미한 리간드-수용체 상호작용을 식별하십시오.이와 같이 세포 간 통신 점 도표(dot plot)를 얻을 수 있습니다. 9단계는 선택 사항입니다. SelectSpatialSpot을 이용한 대화형 스팟 선택 과정입니다.six 스크립트를 사용하여 인터랙티브 도구를 위한 데이터를 준비합니다. GetTissueCoordinates를 사용하여 Seurat 객체에서 공간 좌표를 추출합니다. 데이터를 포맷팅하고 내보냅니다.형성된 데이터 프레임을 CSV 파일로 내보냅니다. 그 다음 관심 영역(region of interest) 분석을 수행합니다. 사용자 정의 프로그램을 실행하십시오.spatial spots dash 애플리케이션을 선택하고 CSV 파일을 불러옵니다. 공간적 위치를 기반으로 스팟을 대화형으로 선택합니다. 그런 다음 선택한 스팟 목록과 할당된 그룹을 새로운 CSV 파일로 내보냅니다.스크립트를 하나씩 실행한 후 얻을 수 있는 결과를 확인하겠습니다. 모든 결과는 results five-fold에 저장됩니다. 보시는 바와 같이, QC 메트릭과 divide를 얻을 수 있습니다.여기에서 공간적 특성 플롯을 확인할 수 있습니다. 또한, 디컨볼루션 과정은 지도 및 비지도 방식 모두로 수행되었습니다. SPOTlight 결과는 여기에 있습니다.보시는 바와 같이, 모든 스폿에는 비율 정보가 포함되어 있습니다. STdeconvolve를 통한 비지도 디콘볼루션(unsupervised deconvolution) 결과 또한 여기서 생성되었습니다. 그리고 이것은 공간 데이터 내 스폿에 대한 Seurat 클러스터링 결과입니다.다음과 같이 공간 팀 플롯(spatial team plot)에서도 시각화할 수 있습니다. 또한 Giotto를 통해 스팟 간 통신(spot-spot communication) 결과도 얻을 수 있습니다. 이 전체 워크플로우는 100% 오픈 소스입니다.발현 지표부터 고급 공간 모델링까지의 스팟 분석 과정입니다. 모든 단계는 16GB RAM이 탑재된 컴퓨터에서 실행됩니다. 코드베이스는 모듈식으로 구성되어 있으며, 각 작업당 하나의 스크립트가 할당되어 있습니다.이 파이프라인은 FASTQ 파일로부터의 업스트림 프로세싱은 다루지 않는다는 점에 유의하십시오. 2D 공간 데이터에 중점을 두고 있으며, 현재는 Visium 다운로더만 포함하고 있습니다. 이것으로 마치겠습니다, 시청해 주셔서 감사합니다.

a-practical-workflow-for-spatial-transcriptomics-data-analysis-from

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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