유전자 전달 증진을 위한 간엽 줄기세포 막 감싸 나노소포 개발

이 프로토콜에서는 세포외 소포와 유사하고 AAV를 캡슐화하여 유전자 전달을 개선하는 중간엽 줄기세포 유래 나노소포를 준비하는 방법을 소개합니다. 이를 AAV가 포함된 나노소포, CME-AAV라고 부릅니다. 신흥 유전자 전달 벡터인 EV-AAV와 비교할 때, CME-AAV는 세포 공급원에 더 큰 유연성과 더 높은 수율을 제공합니다.

먼저, 인간 간엽 줄기세포가 포함된 배양 접시에서 배양지를 70%에서 90%의 합류율로 제거하세요. 세포 스크레이퍼를 사용해 세포를 배양 접시에서 분리하여 PBS가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 수집한 세포를 300g에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠릿으로 분리합니다.

그 후 셀 펠릿을 PBS로 두 번 세척하고 다시 원심분리기를 사용하세요. 최종 세포 펠릿을 PBS에 재현탁시키고 프로테아제 억제제 혼합물을 보완합니다. 그 후 세포 현탁을 세 번의 동결-해동 사이클에 가해 원형질막을 파괴하고 조잡한 용해액을 생성합니다.

피펫을 사용해 용해액을 완전히 균질화하세요. 그 후 1,000g 원심분리기를 4도에서 20분간 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 상정액을 새 튜브로 옮기세요.

18,000g에서 4도 섭씨로 1시간 동안 원심분리하여 막 분획을 펠릿으로 제거하세요. 상청액을 버리고 막 펠릿을 PBS에 재현탁하여 조잡한 간엽 줄기세포 막 분획을 얻습니다. 이제 막 현탁액을 20에서 27게이지 바늘이 장착된 주사기에 순차적으로 통과시켜 균질화합니다.

비신코닉산 분석법을 사용하여 균질화된 막 현탁액의 단백질 농도를 측정합니다. 서스펜션을 분할 단위로 분리해 영하 80도에서 보관하세요. 해동 사이클마다 27게이지 주사기로 현탁액을 다시 균질화하세요.

준비된 막 현탁액을 150마이크로그램 단백질/1 곱하기 10 곱하기 10 게놈 복사본의 제곱 비율로 혼합합니다. 혼합물을 37도 섭씨에서 30분간 부드럽게 흔들어 부양합니다. 멤브레인과 바이러스 혼합물을 400나노미터 폴리카보네이트 멤브레인이 장착된 미니 익스트루더에 넣습니다.

혼합물을 압출기에 20번 통과시켜 캡슐화를 촉진하세요. 400나노미터 멤브레인을 200나노미터 멤브레인으로 교체하고 다시 압출을 반복하세요. 캡슐화된 바이러스와 함께 캡슐화되지 않은 바이러스와 빈 소포를 포함한 공정 현탁물을 수집합니다.

필요하다면 여러 배치를 모아 즉시 정제로 진행하세요. 기본 이오딕사놀 용액을 10x PBS와 멸균된 탈이온수로 희석하여 40% 및 25% 용액을 준비합니다. 피펫을 사용해 13.2밀리리터 개방형 얇은 벽 초투명 튜브 바닥에 40% 아이오딕사놀 1밀리리터를 첨가합니다.

그 다음 40%층 위에 25% 아이오딕사놀 3밀리리터를 겹쳐 불연속적인 구배를 만듭니다. 가공된 현탁액 7밀리리터를 그라데이션 상단에 부드럽게 겹쳐 주세요. 튜브를 균형 있게 배치한 후 스윙 버킷 초원심분리기 로터에 넣으세요.

150,000g에서 4도 섭씨에서 3시간 동안 원심분리기, 빠른 가속과 느린 감속을 사용합니다. 그 다음, 기울기를 방해하지 않고 조심스럽게 튜브를 제거하세요. 1밀리리터 분획을 위에서 아래로 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 표지한 채취.

모든 분수는 얼음 보관하세요. 이제 정제된 CME-AAV가 포함된 7번과 8번 분획을 식별하여 새로운 개방형 초원심분리관에 모으세요. PBS로 볼륨을 11밀리리터로 보충하세요.

그 후 1밀리리터 피펫으로 부드럽게 섞습니다. 빠른 가속과 감속을 이용해 모인 분획을 150,000g 상태로 4도 섭씨에서 3시간 동안 원심분리합니다. 상원액은 조심스럽게 버리세요.

원하는 농도에 따라 50에서 200마이크로리터의 멸균 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 정화된 준비물을 알리콥터로 나누세요. 그 후 80도 섭씨에서 보관하다가 추가 사용을 마시면 됩니다.

멸균된 PBS에 캡슐화된 바이러스와 대제 바이러스의 작동 용액을 준비합니다. 각 웰의 배양액에 동일한 유전체 캡슐화된 바이러스 또는 대조 바이러스를 직접 추가하세요. PBS 또는 빈 바이러스 입자가 동등한 양의 음성 통제 우물을 포함하세요.

플레이트를 부드럽게 돌려 균일한 분포를 보장하고, 실험 설계에 따라 24시간에서 72시간 배양합니다. 다음으로, 배양지를 부드럽게 흡입하세요. 세포를 분리하지 않고 PBS로 두 번 세척하세요.

제조사 지침에 따라 Hoechst 33342로 염색 핵을 사용하세요. 적절한 필터 세트를 장착한 역형 형광현미경을 사용하여 생세포 형광 이미징을 수행하여 녹색 형광 단백질과 호에스트를 강화합니다. 필요 시 정량화를 위해 10배 또는 20배 대물렌즈를, 고해상도 이미징을 위해 63배 대물렌즈를 선택하세요.

동일한 영상 매개변수를 사용하여 우물당 최소 다섯 개의 시야각을 획득하세요. 정량적 분석을 위해 모든 이미지를 RAW와 그레이스케일 형식으로 저장하세요. 투과 전자현미경 검사에서 CME-AAV는 세포외 소포와 유사한 크기와 막 구조를 보였다.

중간엽 줄기세포 막 표지자인 CD73과 CD90은 CME-AAV에서 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다. 세 가지 주요 선도 관련 바이러스 캡시드 단백질인 VP1, VP2, VP3는 SDS-PAGE에 의해 CME-AAV에서 확인되었습니다. NanoSight 분석 결과, CME-AAV9가

EGFP의 평균 직경은 128.6 나노미터였으며, 총 입자 농도는 1.32 곱하기 10에서 10 입자 10의 제곱 곱 분량이었습니다. 형광 현미경 검사에서 CME-AAV9가 입증되었습니다. EGFP는 HEK293T 세포에서 녹색 형광 단백질 발현이 현저히 높게 증가했습니다.

막 외피 바이러스는 약 2.5배 더 높은 유전자 발현을 달성하여 세포 흡수가 증가하고 세포 내 운송이 개선될 가능성을 시사합니다. 생체 내 생물발광 영상 검사 결과, CME-AAV 투여 후 간이 가장 강한 발광 신호를 보였다. 간 영역에 대한 정량적 분석 결과, CME-AAV 투여가 유의하게 높은 유전자 발현 수준을 보였음이 밝혀졌습니다.

이 프로토콜들은 압출 및 밀도 구배 초원심분리를 통해 정제된 세포막 외피 AAV(CME-AAV)를 얻는 단계를 설명합니다. 두 가지 핵심 요소가 신중히 고려해야 합니다: 세포 조각의 전처리(전처리)와 CME-AAV 입자 대 유전체 비율을 조절하기 위한 막 조각-AAV 혼합 비율 최적화. 향후 연구에서는 세포막 폐쇄를 통해 면역 보호와 기능적 표면 특성을 강화하고, CME-AAV를 AAV 전달의 다목적 플랫폼으로 최적화할 수 있습니다.