마우스 부신 피질에서 존 강화된 1차 배양 형성

저의 연구는 부신 미세환경 조절을 조사했으며, 주로 사구체 및 다발 분화, 종양 발생에서 ACM과 Wnt 신호전달에 초점을 맞췄습니다. 기존 방법으로는 부신 영역을 명확히 구분할 수 없습니다. 이 프로토콜은 ZG와 ZF를 풍부하게 하여 다양한 세포 유형의 연구를 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 ZG와 ZF의 부신생리학, 즉 구역 및 세포 분화 연구에도 적용할 수 있습니다. 부신을 분리하여 존 강화 1차 배양을 확보하기 위해, 약 6주에서 7주 된 10마리에서 15마리의 젊은 성체 수컷 마우스를 사용합니다. 안락사 후에는 멸균된 평평한 표면에 등을 대고 눕히고, 동물 털을 70% 알코올로 소독합니다.

가위를 사용해 복부 서혜부 부위에 처음으로 절개를 합니다. 양쪽에서 흉부 쪽으로 측면으로 절개를 확장하여 복막을 노출시킵니다. 피부를 조심스럽게 당겨.

그 후 복부 근육을 부드럽게 당겨 부드신을 노출시키고, 혈관 손상을 피하여 부신을 명확히 볼 수 있도록 하세요. 미생물 오염을 최소화하기 위해 수술 기구를 교체하세요. 후복막에서 왼쪽 신장 위쪽 위쪽에 위치한 왼쪽 부신을 타원형과 분홍색으로 둘러싸고 흰색 지방 조직으로 둘러싸고 있는 것을 식별합니다.

둔탁한 겸자를 사용해 부신의 시야를 높이기 위해 인접한 장기를 조심스럽게 제위하세요. 가위를 사용해 부신을 격리하기 위해 짧고 통제된 절단으로 주변 지방 조직 대부분을 제거합니다. 부신 손상을 막기 위해 부신을 직접 잡지 마세요.

즉시 분리된 부신을 10밀리리터의 미리 가열된 DMEM F-12 배양지를 포함한 P60 배양 접시에 넣어 모든 샘플을 수집할 때까지 보관합니다. 다음으로, 후복막에서 오른쪽 신장 위에 위치한 오른쪽 부신을 식별하는데, 간과 가까워 상행 대장과 인근 혈관이 시각을 더 어렵게 만들 수 있음을 유의하세요. 신정맥과 신동맥을 조심스럽게 다루어 우발적인 베임과 출혈을 방지하세요.

오른쪽 부신을 분리한 후, 왼쪽 부신과 같은 절차를 사용하여 두 선을 같은 접시에 함께 배치합니다. 배양 접시를 70% 알코올로 닦은 후 선을 층류 후드로 옮기세요. 그 후 부신을 PBS가 포함된 접시에 25도 섭씨로 순차적으로 옮겨 세 번 세척합니다.

최종 세척 후에는 분리된 조직을 미리 가열된 DMEM이 포함된 네 번째 접시에 수집 및 유지하여 여러 샘 준비 시 생존력을 유지합니다. 부신을 필터 페이퍼로 옮겨 해부하세요. 다음으로, 미세한 겸자를 사용해 부착된 지방 조직으로 부신을 잡습니다.

캡슐이 손상되지 않도록 필터 페이퍼의 지방을 조절된 동작으로 조심스럽게 해부하세요. 샘이 매끄럽고 온전하며, 과도한 지방과 결합 조직이 없는지 확인하세요. 부신을 신중하게 새 여과지 위에 옮겨 정밀 미세 해부를 용이하게 하세요.

가는 겸자를 사용해 부신 캡슐을 부드럽게 집어 보세요. 메스 칼날을 사용해 조직을 완전히 절단하지 않고 방사선에 방사선 절개를 하세요. 절개 부위를 통해 피질 내부 내용을 밖으로 내보내기 위해 약간의 기계적 압력을 가하세요.

캡슐과 사구체가 겸자 끝에 연결된 상태로 유지하면서 내부 분비선 물질을 노출시킵니다. 배출된 내분비선 물질을 다다구간과 연수로 확인하라. 모든 샘이 처리된 후에만 효소 소화를 시작하여 외부와 내부 영역의 기계적 분리를 보장해야 합니다.

원심분리 후에는 수집한 세포를 배양 배지에 다시 현탁합니다. 부신 세포 배양을 확립한 후, 유전자 발현 분석과 면역염색을 이용해 배양된 세포의 분자 특성 분석을 수행합니다. 1차 부신 세포 배양은 대형구체증 세포에 대해 외측 분획이 풍부하게 된 세포와 부엽구체 세포에 대해 내측 분획에서 성공적으로 확립되었습니다.

계통 추적 마우스 모델은 Cyp11b2 프로모터에 의해 구동되는 구체 구체 특이적 mGFP 발현을 시각화할 수 있게 했습니다. mGFP 발현은 주로 zonaglomerulosa가 풍부한 배양에서 관찰되었고, zona fasciculata가 풍부한 배양에서는 주로 mTomato가 발현되었습니다. 외부 분획 배양에서 Cyp11b2, Dab2, Sonic hedgehog의 상대적 발현 수준이 내측 분획 배양보다 더 높게 관찰되었습니다.

내부 분획 배양에서는 외부 분획 배양에 비해 Cyp11b1과 Akr1b7의 상대적으로 더 높은 발현이 나타났다. zonaglomerulosa가 풍부한 배양에서 알도스테론 분비가 zona fasciculata 풍부 배양보다 높았습니다. 외부 분획 배양에서는 안지오텐신 II, 칼륨, 부신피질자극호르몬 자극 시 알도스테론 분비가 추가로 증가하였다.

코르티코스테론 분비량은 다발대가 풍부한 배양에서 구간구체 풍부 배양균보다 더 높았다. Zona fasciculata 풍부한 배양에서는 아드레노피질자극호르몬과 포스콜린 자극에 반응하여 코르티코스테론 분비가 증가하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 호르몬 생성, 신호 전달 경로, 세포외 기질 등 영역별 생리와 분화를 연구할 수 있게 합니다.

향후 연구에서는 부신 분대 및 분화 메커니즘을 탐구하고, 이 세포들을 이용해 3D 모델을 구축하며 ECM 상호작용을 연구할 수 있습니다.