Name: 완전한 개발 두뇌 속에 생체내에서 단일 세포 Electroporation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-11T18:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 배우세요 완전한 뇌 조직에서 단일 세포 전기천공 기법으로 Xenopus laevis 올챙이 뉴런에 형광 염료를 도입하는 방법을. 이 기술은 생체내 신경 세포 형태와 성장을 실시간 관찰하여 발달 신경과학 연구에 활용됩니다.

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저자는 SCE micromicropipette 팁의 전자 현미경 이미지에 대한 미숙 신경 세포와 데릭 던필드의 시간 경과 영화 캡처 성장을위한 Sharmin Hossain 감사합니다.

장비 설정 : <ol><li> 이 기법에 필요한 전기 장비 자극기, 오실로 스코프 및 micropipette에 삽입하는 은색 철사가 장착되어 micropipette 홀더입니다. 우리는 일반적으로 액슨 악기 Axoporator 800A 자극기를 사용하지만 같은 그라스 악기와 같은 다른 일반적인 stimulators는 SD9 stimulators는 단일 셀 electroporation에도 적합합니다. 자극기는 내부 지휘 솔루션을 포함하고있는 유리 micropipette 안에 배치하는 실버 와이어 전극과 인터페이스 headstage에 연결되어 있습니다. 자극기에서 다른 연결은 또한 올챙이 외부 접지로부터 입력을받는 오실로 스코프 입력에 연결되어 있습니다. 올챙이 외부 접지는 단순히 electroporation 동안 올챙이와 electrotonic 접촉에 남아 은색 와이어입니다. micropipette이 올챙이와 접촉에 배치되면 회로가 완료됩니다. </li><li> 이 책략 공간을 제공하고 micropipette 대해서 30-45 도의 각도에서 가져온 수 있습니다 때문에 단세포 electroporation은 잘 작동 거리 (최소 5cm)와 현미경이 필요합니다. </li></ol> micropipettes의 제조 : 적절한 micropipettes의 작성이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 어려움은 조직을 펑쳐링 때 쉽게 부숴지지 하나 좁은 팁 (직경 1μm 이하)를 균형에있다. 우리는 또한 큰 10도 정도의 테이퍼 각도와 도움말을 바람직하다는 사실을 발견했습니다. <ol><li> 1μm 이하의 팁 직경, 그리고 이상 10도의 팁 테이퍼 각도로 뽑아 유리 micropipette를 준비합니다. <ol><li> 0.75mm의 1.5mm와 내경의 외경과 내부 필라멘트와 Borosilicate 유리가 잘 이러한 목적에 가장 적합합니다. <ol><li> 비교적 두꺼운 유리 팁에 강성의 학위를 제공합니다. </li><li> 내부 필라멘트는 micropipette 팁쪽으로 채워진 액체를 그리기에 중요합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 적절한 도움말 제작은 종종 관찰 결과에 따라 몇 가지 수정을 요구할 것입니다. 다른 조직은 약간 다른 모양 팁 직경과 팁을 요구할 수 있습니다. </li></ol> 단일 셀 electroporation 프로토콜 : 신규 사용자를 위해, 그것은 유전자 코드 형광 단백질과는 달리, 그들은 즉시 epifluorescence 아래에서 볼 수있다, 때문에 형광 dextran의 염료와 함께 시작하는 것이 좋습니다. 형광 염료의 사용은 사용자가 직접 조직 내에서 micropipette 팁의 위치를​​ 볼 수있게하고,시 electroporation은 장비가 제대로 micropipette 팁 적절한 여부를 설정하고되었는지 여부에 대해서 즉각적인 피드백을 제공합니다. <ol><li> 중 로딩 주사기를 사용하거나 백업 작성하여 electroporated하는 화합물의 솔루션 micropipette를 입력합니다. <ol><li> 플라스미드 DNA를 사용하는 경우, 물 속에 준비, 샘플은 내독소 - 무료 확인하고, 1-2μg/ml 사이의 농도에서. </li><li> 형광 dextran의 염료의 농도는 경험적으로 결정하여야한다. 우리는 종종 약 300μM로 물에 희석 형광 염료를 사용합니다. </li><li> 일반적으로, 0.5 - 1μl의 볼륨이 충분합니다. </li><li> 이전 로딩하기 위해 간략하게 괴롭히는가 발생할 수 있습니다 micropipette로 그려진 미립자 파편의 양을 줄이기 위해 고속 솔루션을 원심 분리기. </li><li> 팁 내에 공기 방울은 종종 현재의 흐름에 영향을하고 적극적으로 headstage에 장착하기 전에 micropipette를 flicking하여 dislodged해야합니다. </li></ol></li><li> 홀더에 micropipette를 삽입하거나 headstage 3 축 micromanipulator에 장착. 그 은색 와이어 전극이 micropipette에 삽입하고, 내부 솔루션 electrotonic 연락입니다 확인하십시오. </li><li> 올챙이 양육 매체 (스타 인 버그의 솔루션, 산도 7.4)에 준비가 0.02 % MS - 222 (3 - 아미노 벤 초산 에틸 에스테르)의 침수에 의해 tadpoles를 마취. <ol><li> 우리는 일반적으로 실험에서 무대 44-48 흰둥이 Xenopus laevis tadpoles를 사용합니다. </li><li> Tadpoles는 약 5 분 후에 일반적으로 완전히 anesthetized 있습니다. </li><li> 여러 tadpoles 기다리는 시간을 줄이기 위해 동시에 anesthetized 수 있습니다, 그러나 1 시간 이상의 기간 동안 MS - 222에 노출하지 마십시오. </li></ol></li><li> 플라스틱 전송 micropipette를 사용하여 electroporation 챔버에 하나 anesthetized 올챙이을 전송합니다. <ol><li> electroporation 챔버 쉽게 작은 Sylgard ® 실리콘 블록의 올챙이 모양의 구멍을 조각하고, 그것은 챔버에있는 올챙이와 electrotonic 연락을 것입니다 이러한 캐비티에 은색 접지 와이어를 삽입하여 내부에서 만들 수 있습니다. </li></ol></li><li> 를 사용하여 위치 올챙이 등의 측면 페인트를 moistened. </li><li> 그것은 피부와 접촉에 대한 관심의 영역에 직접 인접한 때까지 micropipette를 낮춥니다. <ol><li> 밀도가 높은 포장 세포 기관과 지역을 타겟팅하면 크게 성공 electroporation의 기회를 증가할 것이다.우리는 일반적으로 올챙이 광학 tectum를 타겟팅할 수 있습니다. </li><li> 30-45 도의 각도에서 micropipette 가져와. 험한 각도가 자주 하나 전망을 방해하면서 얕은 궤도는 피부 찔린 더 어렵게합니다. </li></ol></li><li> 지속적인 micropipette의 저하 처음 피부 보조개 다음 기본 조직으로 통과됩니다. <ol><li> 피상적인 세포는 생체내 이미징에 대한 선호하고 있으며, micropipette 팁은 피부의 dimpling에 따라 천천히 저하되어함으로써 타겟팅할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 하나는 지속되면 조직 내에 위치 micropipette 저항을 모니터링해야합니다. Axoporator 800A (액슨 인 스트 루먼트), 약 10 40MΩ의 resistances를 사용하는 경우 최적입니다. 저항의 팁 직경은 단일 셀 electroporation에 적합한지 여부의 좋은 지표입니다. <ol><li> 하이 micropipette의 resistances은 (&gt; 100MΩ) 너무 좁고 조언들로 가득 찼어 팁 또는 micropipettes 나타내는 있습니다. </li><li> 낮은 micropipette의 resistances (&lt;10MΩ)는 종종 깨진 팁의 결과가 너무 커서 팁 직경을 나타내는 있습니다. </li><li> 직접 저항 측정을 제공하지 않습니다 자극기를 사용하는 경우, micropipette 저항은 간접적으로 오실로 스코프 (아래 설명)에 의해 측정 전압 펄스의 진폭을 관찰하여 측정하실 수 있습니다. </li></ol></li><li> 전압 열차를 적용합니다. <ol><li> 플라스미드 DNA를, 펄스는 500ms의 펄스 트레인 기간과 300Hz에서 제공 기간이 1ms 부정 사각형 웨이브 펄스의 이루어져 가장 효과적으로 발견 열차. <ol><li> 펄스 전압은 오실로 스코프에서 측정된 펄스의 진폭이 0.75과 1.5μA 사이는 것을 경험적으로 그러한 결정됩니다. </li></ol></li><li> 형광 염료 dextran의 경우, 300μs 기간의 긍정적인 사각형 웨이브 펄스는 10ms의 펄스 트레인 기간과 300Hz의 주파수에서 전달됩니다. <ol><li> DNA에 대한 프로토콜과 마찬가지로 펄스 전압은 오실로 스코프에서 측정된 펄스의 진폭이 0.75과 1.5μA 사이는 것을 경험적으로 그러한 결정됩니다. </li><li> 자극 매개 변수 추가 조정은 epifluorescence 아래 electroporation의 결과를 관찰을 바탕으로 만들 수 있습니다. <ol><li> electroporated 세포가 희미 나타나면 세포가 밝은 나타날 때까지, 펄스 매개 변수는 점차 증가한다. </li><li> 세포의 클러스터는 레이블이있는 경우 하나의 세포가 표시되기 전까지는 반면에, 펄스 매개 변수는 감소한다. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> micropipette을 접어야 조직 내의 다른 사이트에 다시 삽입하고, 전압 기차를 적용할 수 있습니다. <ol><li> 수율을 개선하기 위해, 우리는 일반적으로 해당 레이블이 붙은 세포가 중복되지 않도록 충분한 간격 올챙이 광학 tectum 각 반구에서 여러 사이트를 electroporate. </li></ol></li><li> 스타 인 버그의 양육 솔루션 컨테이너에 electroporated 올챙이을 전송합니다. <ol><li> Tadpoles는 빠른 속도로 몇 분 이내에 마취에서 회복됩니다. </li></ol></li><li> 동일한 micropipette는 수많은 tadpoles 사용할 수 있습니다. 끊임없이 오실로 스코프에서 발견된 펄스의 진폭을 관찰하는 것이 중요합니다. <ol><li> 펄스 진폭이 크게 펄스 강도를 증가 후 낮은 남아있다면 이런 현상이 가능성이 한 번에 많은 tadpoles를 electroporating 때 종종 볼 수 막힌되는 팁의 결과입니다. <ol><li> 사소한 팁 방해할을 이동시키다하는 방법은 조직에 micropipette 삽입 후 하나의 긍정적인 펄스를 적용하는 것입니다. </li><li> 덩어리가 dislodged, 또는 자주 반복을 막히​​는 수없는 경우, micropipette를 교체하십시오. </li></ol></li><li> 펄스 진폭이 크게 펄스 매개 변수를 감소 이후 매우 큰 남아있을 경우, 이것은 끝 고장 및 교체해야하는 기호입니다. </li></ol></li></ol> 성공적으로 electroporated 세포에 대한 검사 : <ol><li> electroporation 후, tadpoles는 똑바로 epifluorescence 현미경을 사용하여 레이블이 세포에 대한 검사를하고 있습니다. </li><li> 형광 염료의 경우, tadpoles는 빠르면 30 분 이후 electroporation 후 심사 수 있습니다. <ol><li> 우리는 더 이상 간격이 낮은 배경 형광 수준과 연관된 것을, 그러나 발견했다. </li></ol></li><li> 유전자 인코딩 형광 단백질의 경우, 심사는 일반적으로 최소 12 시간 이후의 electroporation을 실시합니다. <ol><li> 형광 단백질을 표현하는 세포는 시간을 더 밝게하려면 것입니다 따라서 희미한 전지 12~24시간의 추가 간격 후 다시 심사 수 있습니다. </li></ol></li><li> Sylgard ® 챔버에 배치, 위에서 설명한 및 coverslipped로 Tadpoles는 anesthetized 있습니다. 개인 tadpoles는 다음 epifluorescence에 따라 심사됩니다. <ol><li> epifluorescence 빛에 과도하게 노출이 표시된 세포를 죽일 수 있습니다 phototoxicity 발생됩니다. 따라서 세포가 형광 불빛에 노출되는 시간을 최소화합니다. </li></ol></li><li> 스타 인 버그의 양육 솔루션 컨테이너에 tadpoles를 반환합니다. </li></ol>

<ol><li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).</li>
<li>Dunfield, D., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Neuroscience+%284th+Ed.%29%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation.</a> Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , Elsevier, Amsterdam. In press Forthcoming.</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
</ol>

단일 셀 electroporation (SCE)는 유전자 기능을 결정하고 타겟 유전자 조작을 수행하기위한 강력한 도구입니다. 흰둥이 올챙이의 투명성과 두뇌의 접근이 이상적으로 살아있는 유기체 내에서 성장과 세포의 연결 이벤트를 시각화에 적합한이 모델 시스템을합니다. SCE는 단일 신경 세포의 성장의 시각화를 허용하고, 그렇지 않으면 변형 두뇌 속에 휴대 자율 조​​작을 수행할 수 있습니다. 이 동영상이 문서 Xenopus laevis tadpoles에서 단일 셀 electroporation에 대한 절차를 보여주는 동안,이 기법은 다른 생물에서 사용되었으며, hippocampal 조각과 dissociated 셀 문화도 사용되고 있습니다.

완전한 개발 두뇌 속에 생체내에서 단일 세포 electroporation

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

단일 셀 electroporation (SCE)는 생체내 준비를 포함한 그대로 조직 내의 개별 세포로 DNA 또는 기타 macromolecules의 전달을 허용하는 전문 기술입니다. 이 기법의 독특한 장점은 주변 조직이 변형 떠나는 동안 실험 조작은이를 통해 글로벌 트리 트먼트로 인한 사람의 휴대 자율 효과를 구별, 각각의 세포에서 수행할 수 있습니다됩니다. 생체내 이미징 기술의 고급과 결합하면 형광 마커 SCE는 세포 형태, 세포 성장, 그리고 초에서 일까지 timescales 이상의 세포 사건의 직접적인 시각화 수 있습니다. 이 기법은 생체내 및 전직 생체내 준비의 다양한 사용되지만, 우리는 Xenopus laevis의 tadpoles에 사용하기 위해이 기술을 최적화합니다. 이 동영상이 문서에서 우리는 세부 흰둥이 Xenopus 올챙이의 손상 뇌 내의 뉴런에 형광 염료 또는 플라스미드 DNA의 SCE에 대한 절차를. 우리는 또한 수율을 최적화하기위한 방법을 논의하고, 찬란 SCE에 의해 분류 뉴런의 사는 두 개의 광자 형광 이미징의 예를 보여줍니다.

단일 셀 electroporation (SCE)는 생체내 준비를 포함한 그대로 조직 내의 개별 세포로 DNA 또는 기타 macromolecules의 전달을 허용하는 전문 기술입니다. Xenopus laevis 올챙이의 손상 뇌 내의 뉴런에 형광 염료 또는 플라스미드 DNA의 SCE에 대해 우리가 세부 절차를.

완전한 개발 두뇌 속에 생체내에서 단일 세포 Electroporation

단일 세포 전기천공법(Single-cell electroporation, SCE)은 온전한 상태의 ... 내에 있는 개별 세포로 DNA 또는 기타 거대 분자를 전달할 수 있게 하는 특수 기술입니다.

단일 세포 전기천공법은 DNA 또는 기타 거대 분자를 조직이 온전한 상태의 개별 세포 내로 전달할 수 있게 하는 전문 기술이며, 고급 생체 내 이미징 기술과 결합할 경우 생체 내 준비물에서도 적용이 가능합니다. 형광 마커의 단일 세포 전기천공법을 이용하면 수 초에서 수 일에 이르는 시간 범위 동안 세포 형태, 세포 성장 및 세포 간 상호작용 사건을 직접 시각화할 수 있습니다. 본 영상에서는 XUS 올챙이의 온전한 뇌 내 뉴런에 형광 염료 또는 플라스마 DNA를 단일 세포 전기천공법으로 전달하는 절차를 상세히 설명하고, 형광 표지된 뉴런의 실시간 이미징 사례를 보여줍니다.안녕하세요. 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 뇌 연구 센터의 Kurt Haass 박사님 실험실에서 근무하는 Eth Haa입니다. 오늘은 알비노 XUS Lavis 올챙이의 온전한 뇌 내에 있는 뉴런을 대상으로 표적 단일 세포 전기천공법을 수행하는 방법을 시연하겠습니다.이 기술의 뚜렷한 장점은 주변 조직을 변경하지 않고 개별 세포에 대해 실험적 조작을 수행할 수 있다는 것이며, 이를 통해 세포 자율적 효과와 전신 처리에 의한 효과를 구분할 수 있다는 점입니다. 첫 번째 단계에서는 적절한 팁 직경과 테이퍼 각도를 가진 마이크로피펫을 제작하고, 이어서 마이크로피펫에 전이 물질을 로딩합니다. 그런 다음 TA 풀을 마취시켜 고정 챔버로 옮긴 후, 뇌에 마이크로피펫을 삽입하고 일련의 전압 펄스를 가합니다.마지막으로, 표지된 뉴런을 이광자 현미경으로 이미징합니다. 여기서는 올챙이를 이용해 이 기술을 보여드릴 것입니다. 단일 세포 표지는 ex vivo 준비물뿐만 아니라 다른 모델 시스템에서도 사용할 수 있습니다.이를 염두에 두고 시작해 보겠습니다. 단일 세포 전기천공법은 유리 마이크로 피펫 전극을 사용하여 개별 세포를 표적으로 하며, 이 전극은 전기장을 피펫 팁과 접촉하고 있는 단일 세포로 제한합니다. 피펫 팁의 물리적 기하학적 구조는 이 기술의 성공에 직접적인 영향을 미치는 결정적인 요소입니다.외경 1.5 millimeters, 내경 0.75 millimeters이며 팁 내부의 기포 없는 충전을 돕기 위한 내부 필라멘트가 포함된 붕규산 유리로 마이크로 피펫을 제작하기 위해 P 97 풀러 솔더 모델을 사용합니다. 단일 세포 전기천공법에 가장 효과적인 것으로 확인된 피펫 팁은 팁 직경이 0.5 ~ 1 micron이며 테이퍼 각도가 10도 이상인 것입니다. 유리 마이크로 피펫을 제작한 후, 역충전 방식이나 로딩 주사기를 사용하여 용액 상태의 전송 물질을 피펫에 채울 수 있습니다.본 시연에서는 여기에 보이는 형광 염료 또는 GFP(녹색 형광 단백질)를 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 단일 뉴런을 형광 표지하겠습니다. 피펫으로 흡입되는 입자성 잔해물의 양을 줄이기 위해 GFP 녹색 형광 단백질 용액을 고속으로 짧게 원심 분리해야 합니다. 숙련되지 않은 사용자의 경우 팁이 막힐 가능성이 높아지므로, 에피 형광 현미경 하에서 쉽게 확인할 수 있는 형광 염료부터 시작하는 것이 좋습니다.이를 통해 샘플 내의 팁 위치를 시각화할 수 있으며, 장비가 적절하게 설정되었는지와 피펫 팁이 적절한지에 대한 직접적인 피드백을 얻을 수 있습니다. 수고하셨습니다. 마이크로 피펫 준비가 완료되었으므로, 이제 단일 세포 전기천공법 절차를 수행하는 단계로 넘어가겠습니다.이 기술에 필요한 전기 장비는 자극기와 오실로스코프, 그리고 피펫에 삽입할 은선이 장착된 피펫 홀더입니다. 여기서는 axon instrument의 ax separator 800 A를 사용하지만, grass SD nine과 같은 일반적인 자극기도 사용할 수 있습니다. ax separator는 ax separator와 은선 전극 사이의 인터페이스 역할을 하는 헤드 스테이지에 연결됩니다.올챙이 외부 접지는 올챙이와 전자적 접촉을 유지하는 단순한 은선입니다. 전기천공법 수행 시, 헤드 스테이지, 접지 리드 및 올챙이 외부 접지가 모두 오실로스코프 입력단에 연결됩니다. 전기 장비 설정이 완료되면, 피펫 홀더에 피펫을 장착할 수 있습니다.피펫 홀더는 미세 이동이 가능한 3축 마이크로 매니퓰레이터에 장착해야 합니다. 단일 세포 전기천공법에는 작동 거리(working distance)가 충분한 현미경이 필요합니다. 이는 조작 공간을 더 많이 확보해주며 피펫을 약 30도에서 45도 각도로 진입시킬 수 있게 하기 때문입니다.장비 연결이 제대로 완료되면, 단일 세포 전기천공법 절차를 시작할 수 있습니다. 먼저 올챙이를 0.02%MS 2, 2 2에 침지시켜 마취하며, 일반적으로 올챙이들이 완전히 마취됩니다. 약 5분 후, 올챙이 한 마리를 전기천공 챔버로 옮깁니다.플라스틱 전이 피펫을 사용하여, 작은 실리콘 블록에 올챙이 모양의 공동을 파내고 챔버 내에서 올챙이 피부와 접촉할 수 있도록 은 접지선을 삽입함으로써 챔버를 자체적으로 쉽게 제작할 수 있습니다. 다음으로, 페인트 붓을 사용하여 올챙이의 위치를 잡으면 등 쪽이 위로 향하게 할 수 있습니다. 그 후, 마이크로 피펫을 관심 영역에 직접 인접한 피부에 닿을 때까지 내립니다.피펫을 계속해서 내리면 처음에는 피부가 약간 들어갔다가 이후 하부 조직으로 통과하게 됩니다. 여기서는 톱ㅌ리폴(tide pole) 뇌의 시각엽(optic tum)을 목표로 하고 있습니다. 특히 세포체 층 영역을 겨냥하고 있습니다.xi를 사용하는 경우, 조직 내 피펫의 저항을 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로 저항은 10에서 약 40 Mega ohms 범위일 때 적절합니다.피펫의 저항은 팁 직경이 너무 작거나 팁이 막혔는지 여부를 판단하는 좋은 지표가 되며, 이 경우 저항값이 높게 나타납니다. 반대로, 팁 직경이 너무 크거나 팁이 파손된 경우에는 피펫 저항이 낮아집니다. 일반적인 자극기를 사용할 때는 절대 저항인 피펫 저항을 측정할 수 없습니다.오실로스코프 판독값은 형광 덱스트란 염료에 대한 피펫 저항의 간접적인 측정치입니다. 자극은 300 hertz의 빈도로 가해지는 10 millisecond의 양의 방형파 펄스 열로 구성됩니다. 개별 펄스의 지속 시간은 300 microseconds이며 50 volts의 전압으로 전달됩니다.이러한 설정을 사용하여, 전기 프로빙 후 자극을 가하면 팁에서 형광 염료가 방출되는 것을 확인할 수 있습니다. 한 지점에서 피펫을 회수하고 조직 내의 다른 여러 지점에서 이 과정을 반복하여 수율을 높입니다. 전압 펄스 트레인이 전달되는 동안, 오실로스코프에서 발생하는 펄스의 진폭을 모니터링하고 필요한 경우 진폭을 1에서 1.5 µA 사이로 조정해야 합니다.전압을 상당히 높인 후에도 펄스 진폭이 낮게 유지되거나 실험 과정 중에 진폭이 감소한다면, 이는 팁이 막혔거나 팁 직경이 너무 작음을 강력하게 시사합니다. 이러한 현상이 발생하면 매우 당혹스러울 수 있습니다. 반대로, 인가 전압을 상당히 낮춘 후에도 진폭이 여전히 높거나 실험 과정 중에 진폭이 상승한다면, 이는 팁이 너무 넓거나 팁이 파손되었음을 강력하게 나타냅니다.저는 종종 매우 감정적이 되고 슬퍼지곤 합니다. 앞서 언급했듯이, 형광 염료를 사용하는 것의 장점은 주어진 자극 파라미터를 사용하여 단일 세포가 전기천공되었는지 즉시 확인할 수 있다는 점입니다. 세포가 매우 희미하게 보이거나 표지된 세포가 없는 경우, 이와 같이 표지된 세포가 밝게 보일 때까지 각 자극 파라미터를 독립적으로 서서히 증가시키는 것부터 시작하십시오. 멋지게 표지된 세포를 보는 것은 저에게 큰 기쁨이 됩니다.반면에, 너무 많은 세포가 라벨링된 것으로 보이면, 이 세포처럼 단일 세포만 밝게 라벨링될 때까지 자극 파라미터를 점진적으로 감소시켜야 합니다. 밝게 라벨링된 세포를 확인하는 것은 매우 만족스러운 작업입니다. 플라스미드 DNA의 경우, 사용되는 펄스 트레인은 300 Hz의 주파수로 전달되는 1 ms 지속 시간의 음성 펄스이며, 트레인 지속 시간은 500 ms입니다.전기천공법 이후, 올챙이 극들은 신선한 사육액으로 옮겨지며 여기서 빠르게 마취 상태에서 회복됩니다. 일반적으로 50~100마리의 올챙이 극에 전기천공을 실시한 후, 다음 단계에서 보여드릴 스크리닝 과정을 진행할 수 있습니다. 이미징 실험을 시작하기 전에 정립형 에피 형광 현미경을 사용하여 전기천공된 올챙이들을 빠르게 스크리닝하는 것이 유용합니다.이미징에 적합한 뉴런을 포함하고 있는 올챙이를 판별하기 위해, 올챙이를 마취시킨 후 시가 챔버(cigar chamber)에 넣고 커버슬립을 덮습니다. 그 다음, 개별 올챙이의 뇌를 에피 형광광(epi fluorescent light) 아래에서 빠르게 관찰하여 단일 형광 표지 뉴런이 존재하는지 확인합니다. 에피 형광광에 과도하게 노출되면 광독성이 발생하여 표지된 세포가 사멸할 수 있으므로, 세포가 형광광에 노출되는 시간을 최소화하십시오.덱스트란 염료의 경우, 전기천공 후 30분 만에 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 하지만 간격을 더 길게 둘수록 배경 형광 수준이 낮아지는 것을 확인하였습니다. 플라스미드의 경우, DNA 스크리닝은 일반적으로 전기천공 후 최소 12시간 후에 수행합니다.우리는 올챙이 시각피질 내의 뉴런을 형광 표지하기 위해 단일 세포 전기천공법을 일상적으로 사용합니다. 당사의 이광자 현미경은 Olympus FV 300 공초점 현미경과 Chameleon XP 레이저 광원을 사용하여 맞춤 제작되었습니다. 녹색 형광을 이미지화하기 위해 일반적으로 910 nanometers의 파장을 사용합니다.단일 표지된 AL 뉴런이 있는 올챙이를 찾아 이광자 현미경 장치에 배치한 후, 다양한 시간 간격에 걸쳐 촉각 뉴런의 타임랩스 광자 이미징을 수행합니다. 이를 통해 AL 세포의 수지상 돌기 분지(dendritic arbors)의 역동적인 성장 패턴을 관찰할 수 있습니다. 여기서는 단일 세포 전기천공법을 사용하여 표지된 GFP 발현 뉴런의 예를 볼 수 있습니다.이 이미지는 뉴런의 성장을 정량화하기 위해 생체 내(in vivo) 이광자 현미경을 사용하여 촬영되었습니다. 일반적으로 각 뉴런 이미지의 골격화된 3차원 재구성이 생성됩니다. 긴 간격의 시차 촬영(Time-lapse imaging)을 통해 실험적 조작의 장기적인 결과에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.여기에서 우리는 수지상 돌기 네트워크가 정교해지는 4일 동안 매일 촬영한 미성숙 GFP 발현 뉴런을 볼 수 있습니다. 이 이미지들은 이광자 현미경을 사용하여 캡처되었으며 Z-축 투영(Z projection)으로 제시되었습니다. 신속한 타임랩스 이미징을 통해 수지상 돌기 사상돌기의 형성 및 퇴행을 포함하여 뉴런 성장의 보다 역동적인 과정의 특성을 관찰할 수 있습니다.이 영상은 1시간 동안 2분 간격으로 3차원 이미징을 수행한, 비교적 성숙한 GFP 발현 뉴런을 보여줍니다. 다음은 1시간 동안 5분 간격으로 이미징한 미성숙 GFP 발현 뉴런의 예시입니다. 어린 뉴런은 매우 역동적이며 광범위한 분지 성장과 분지 수축을 보입니다.GFP를 발현하는 이 뉴런의 확대 영상은 이 시스템의 발달 중인 뉴런에서 전형적으로 나타나는 수지상 돌기 필로포디아(filopodia)의 지속적인 생성과 회수 과정을 보여줍니다. 알비노 올챙이의 투명함과 뇌에 대한 접근성은 이 모델 시스템을 살아있는 유기체 내에서 뉴런의 성장과 세포 내 사건을 시각화하는 데 매우 이상적으로 만들어 줍니다. 단일 세포 전기천공법을 통해 우리는 단일 뉴런의 성장을 시각화하고, 그 외에는 변화가 없는 뇌 내에서 세포 자율적 조작을 수행할 수 있습니다.지금까지 zebrafish 태아 극(TA poles)에서의 단일 세포 전기천공법 수행 방법을 살펴보았습니다. 본 영상에서는 TA poles의 전기천공법에 집중했지만, 이 기술은 다른 생물체뿐만 아니라 해마 절편 및 해리된 세포 배양에도 사용되어 왔습니다. 이 절차를 수행할 때는 높은 수율을 유지하기 위해 피펫 팁과 자극 파라미터를 지속적으로 수정하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을...

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.

신생아 Pial 표면 에레

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

여기에 제시된 자궁 전기화에서 사용하는 배아 페렛 뇌에서 유전자 조작을 수행하는 프로토콜이 있다. 이 방법은 생체 내의 신피질에서 신경 전구 세포를 표적으로 하는 것을 허용합니다.

자궁 에서 뇌포화에 의해 페렛 신피질에서 신경 전구 세포의 생체 포팅

배우세요 완전한 뇌 조직에서 단일 세포 전기천공 기법으로 Xenopus laevis 올챙이 뉴런에 형광 염료를 도입하는 방법을. 이 기술은 생체내 신경 세포 형태와 성장을 실시간 관찰하여 발달 신경과학 연구에 활용됩니다.

완전한 개발 두뇌 속에 생체내에서 단일 세포 Electroporation

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