완전한 개발 두뇌 속에 생체내에서 단일 세포 Electroporation

단일 세포 전기천공법은 DNA 또는 기타 거대 분자를 조직이 온전한 상태의 개별 세포 내로 전달할 수 있게 하는 전문 기술이며, 고급 생체 내 이미징 기술과 결합할 경우 생체 내 준비물에서도 적용이 가능합니다. 형광 마커의 단일 세포 전기천공법을 이용하면 수 초에서 수 일에 이르는 시간 범위 동안 세포 형태, 세포 성장 및 세포 간 상호작용 사건을 직접 시각화할 수 있습니다. 본 영상에서는 XUS 올챙이의 온전한 뇌 내 뉴런에 형광 염료 또는 플라스마 DNA를 단일 세포 전기천공법으로 전달하는 절차를 상세히 설명하고, 형광 표지된 뉴런의 실시간 이미징 사례를 보여줍니다.

안녕하세요. 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 뇌 연구 센터의 Kurt Haass 박사님 실험실에서 근무하는 Eth Haa입니다. 오늘은 알비노 XUS Lavis 올챙이의 온전한 뇌 내에 있는 뉴런을 대상으로 표적 단일 세포 전기천공법을 수행하는 방법을 시연하겠습니다.

이 기술의 뚜렷한 장점은 주변 조직을 변경하지 않고 개별 세포에 대해 실험적 조작을 수행할 수 있다는 것이며, 이를 통해 세포 자율적 효과와 전신 처리에 의한 효과를 구분할 수 있다는 점입니다. 첫 번째 단계에서는 적절한 팁 직경과 테이퍼 각도를 가진 마이크로피펫을 제작하고, 이어서 마이크로피펫에 전이 물질을 로딩합니다. 그런 다음 TA 풀을 마취시켜 고정 챔버로 옮긴 후, 뇌에 마이크로피펫을 삽입하고 일련의 전압 펄스를 가합니다.

마지막으로, 표지된 뉴런을 이광자 현미경으로 이미징합니다. 여기서는 올챙이를 이용해 이 기술을 보여드릴 것입니다. 단일 세포 표지는 ex vivo 준비물뿐만 아니라 다른 모델 시스템에서도 사용할 수 있습니다.

이를 염두에 두고 시작해 보겠습니다. 단일 세포 전기천공법은 유리 마이크로 피펫 전극을 사용하여 개별 세포를 표적으로 하며, 이 전극은 전기장을 피펫 팁과 접촉하고 있는 단일 세포로 제한합니다. 피펫 팁의 물리적 기하학적 구조는 이 기술의 성공에 직접적인 영향을 미치는 결정적인 요소입니다.

외경 1.5 millimeters, 내경 0.75 millimeters이며 팁 내부의 기포 없는 충전을 돕기 위한 내부 필라멘트가 포함된 붕규산 유리로 마이크로 피펫을 제작하기 위해 P 97 풀러 솔더 모델을 사용합니다. 단일 세포 전기천공법에 가장 효과적인 것으로 확인된 피펫 팁은 팁 직경이 0.5 ~ 1 micron이며 테이퍼 각도가 10도 이상인 것입니다. 유리 마이크로 피펫을 제작한 후, 역충전 방식이나 로딩 주사기를 사용하여 용액 상태의 전송 물질을 피펫에 채울 수 있습니다.

본 시연에서는 여기에 보이는 형광 염료 또는 GFP(녹색 형광 단백질)를 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 단일 뉴런을 형광 표지하겠습니다. 피펫으로 흡입되는 입자성 잔해물의 양을 줄이기 위해 GFP 녹색 형광 단백질 용액을 고속으로 짧게 원심 분리해야 합니다. 숙련되지 않은 사용자의 경우 팁이 막힐 가능성이 높아지므로, 에피 형광 현미경 하에서 쉽게 확인할 수 있는 형광 염료부터 시작하는 것이 좋습니다.

이를 통해 샘플 내의 팁 위치를 시각화할 수 있으며, 장비가 적절하게 설정되었는지와 피펫 팁이 적절한지에 대한 직접적인 피드백을 얻을 수 있습니다. 수고하셨습니다. 마이크로 피펫 준비가 완료되었으므로, 이제 단일 세포 전기천공법 절차를 수행하는 단계로 넘어가겠습니다.

이 기술에 필요한 전기 장비는 자극기와 오실로스코프, 그리고 피펫에 삽입할 은선이 장착된 피펫 홀더입니다. 여기서는 axon instrument의 ax separator 800 A를 사용하지만, grass SD nine과 같은 일반적인 자극기도 사용할 수 있습니다. ax separator는 ax separator와 은선 전극 사이의 인터페이스 역할을 하는 헤드 스테이지에 연결됩니다.

올챙이 외부 접지는 올챙이와 전자적 접촉을 유지하는 단순한 은선입니다. 전기천공법 수행 시, 헤드 스테이지, 접지 리드 및 올챙이 외부 접지가 모두 오실로스코프 입력단에 연결됩니다. 전기 장비 설정이 완료되면, 피펫 홀더에 피펫을 장착할 수 있습니다.

피펫 홀더는 미세 이동이 가능한 3축 마이크로 매니퓰레이터에 장착해야 합니다. 단일 세포 전기천공법에는 작동 거리(working distance)가 충분한 현미경이 필요합니다. 이는 조작 공간을 더 많이 확보해주며 피펫을 약 30도에서 45도 각도로 진입시킬 수 있게 하기 때문입니다.

장비 연결이 제대로 완료되면, 단일 세포 전기천공법 절차를 시작할 수 있습니다. 먼저 올챙이를 0.02%MS 2, 2 2에 침지시켜 마취하며, 일반적으로 올챙이들이 완전히 마취됩니다. 약 5분 후, 올챙이 한 마리를 전기천공 챔버로 옮깁니다.

플라스틱 전이 피펫을 사용하여, 작은 실리콘 블록에 올챙이 모양의 공동을 파내고 챔버 내에서 올챙이 피부와 접촉할 수 있도록 은 접지선을 삽입함으로써 챔버를 자체적으로 쉽게 제작할 수 있습니다. 다음으로, 페인트 붓을 사용하여 올챙이의 위치를 잡으면 등 쪽이 위로 향하게 할 수 있습니다. 그 후, 마이크로 피펫을 관심 영역에 직접 인접한 피부에 닿을 때까지 내립니다.

피펫을 계속해서 내리면 처음에는 피부가 약간 들어갔다가 이후 하부 조직으로 통과하게 됩니다. 여기서는 톱ㅌ리폴(tide pole) 뇌의 시각엽(optic tum)을 목표로 하고 있습니다. 특히 세포체 층 영역을 겨냥하고 있습니다.

xi를 사용하는 경우, 조직 내 피펫의 저항을 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로 저항은 10에서 약 40 Mega ohms 범위일 때 적절합니다.

피펫의 저항은 팁 직경이 너무 작거나 팁이 막혔는지 여부를 판단하는 좋은 지표가 되며, 이 경우 저항값이 높게 나타납니다. 반대로, 팁 직경이 너무 크거나 팁이 파손된 경우에는 피펫 저항이 낮아집니다. 일반적인 자극기를 사용할 때는 절대 저항인 피펫 저항을 측정할 수 없습니다.

오실로스코프 판독값은 형광 덱스트란 염료에 대한 피펫 저항의 간접적인 측정치입니다. 자극은 300 hertz의 빈도로 가해지는 10 millisecond의 양의 방형파 펄스 열로 구성됩니다. 개별 펄스의 지속 시간은 300 microseconds이며 50 volts의 전압으로 전달됩니다.

이러한 설정을 사용하여, 전기 프로빙 후 자극을 가하면 팁에서 형광 염료가 방출되는 것을 확인할 수 있습니다. 한 지점에서 피펫을 회수하고 조직 내의 다른 여러 지점에서 이 과정을 반복하여 수율을 높입니다. 전압 펄스 트레인이 전달되는 동안, 오실로스코프에서 발생하는 펄스의 진폭을 모니터링하고 필요한 경우 진폭을 1에서 1.5 µA 사이로 조정해야 합니다.

전압을 상당히 높인 후에도 펄스 진폭이 낮게 유지되거나 실험 과정 중에 진폭이 감소한다면, 이는 팁이 막혔거나 팁 직경이 너무 작음을 강력하게 시사합니다. 이러한 현상이 발생하면 매우 당혹스러울 수 있습니다. 반대로, 인가 전압을 상당히 낮춘 후에도 진폭이 여전히 높거나 실험 과정 중에 진폭이 상승한다면, 이는 팁이 너무 넓거나 팁이 파손되었음을 강력하게 나타냅니다.

저는 종종 매우 감정적이 되고 슬퍼지곤 합니다. 앞서 언급했듯이, 형광 염료를 사용하는 것의 장점은 주어진 자극 파라미터를 사용하여 단일 세포가 전기천공되었는지 즉시 확인할 수 있다는 점입니다. 세포가 매우 희미하게 보이거나 표지된 세포가 없는 경우, 이와 같이 표지된 세포가 밝게 보일 때까지 각 자극 파라미터를 독립적으로 서서히 증가시키는 것부터 시작하십시오. 멋지게 표지된 세포를 보는 것은 저에게 큰 기쁨이 됩니다.

반면에, 너무 많은 세포가 라벨링된 것으로 보이면, 이 세포처럼 단일 세포만 밝게 라벨링될 때까지 자극 파라미터를 점진적으로 감소시켜야 합니다. 밝게 라벨링된 세포를 확인하는 것은 매우 만족스러운 작업입니다. 플라스미드 DNA의 경우, 사용되는 펄스 트레인은 300 Hz의 주파수로 전달되는 1 ms 지속 시간의 음성 펄스이며, 트레인 지속 시간은 500 ms입니다.

전기천공법 이후, 올챙이 극들은 신선한 사육액으로 옮겨지며 여기서 빠르게 마취 상태에서 회복됩니다. 일반적으로 50~100마리의 올챙이 극에 전기천공을 실시한 후, 다음 단계에서 보여드릴 스크리닝 과정을 진행할 수 있습니다. 이미징 실험을 시작하기 전에 정립형 에피 형광 현미경을 사용하여 전기천공된 올챙이들을 빠르게 스크리닝하는 것이 유용합니다.

이미징에 적합한 뉴런을 포함하고 있는 올챙이를 판별하기 위해, 올챙이를 마취시킨 후 시가 챔버(cigar chamber)에 넣고 커버슬립을 덮습니다. 그 다음, 개별 올챙이의 뇌를 에피 형광광(epi fluorescent light) 아래에서 빠르게 관찰하여 단일 형광 표지 뉴런이 존재하는지 확인합니다. 에피 형광광에 과도하게 노출되면 광독성이 발생하여 표지된 세포가 사멸할 수 있으므로, 세포가 형광광에 노출되는 시간을 최소화하십시오.

덱스트란 염료의 경우, 전기천공 후 30분 만에 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 하지만 간격을 더 길게 둘수록 배경 형광 수준이 낮아지는 것을 확인하였습니다. 플라스미드의 경우, DNA 스크리닝은 일반적으로 전기천공 후 최소 12시간 후에 수행합니다.

우리는 올챙이 시각피질 내의 뉴런을 형광 표지하기 위해 단일 세포 전기천공법을 일상적으로 사용합니다. 당사의 이광자 현미경은 Olympus FV 300 공초점 현미경과 Chameleon XP 레이저 광원을 사용하여 맞춤 제작되었습니다. 녹색 형광을 이미지화하기 위해 일반적으로 910 nanometers의 파장을 사용합니다.

단일 표지된 AL 뉴런이 있는 올챙이를 찾아 이광자 현미경 장치에 배치한 후, 다양한 시간 간격에 걸쳐 촉각 뉴런의 타임랩스 광자 이미징을 수행합니다. 이를 통해 AL 세포의 수지상 돌기 분지(dendritic arbors)의 역동적인 성장 패턴을 관찰할 수 있습니다. 여기서는 단일 세포 전기천공법을 사용하여 표지된 GFP 발현 뉴런의 예를 볼 수 있습니다.

이 이미지는 뉴런의 성장을 정량화하기 위해 생체 내(in vivo) 이광자 현미경을 사용하여 촬영되었습니다. 일반적으로 각 뉴런 이미지의 골격화된 3차원 재구성이 생성됩니다. 긴 간격의 시차 촬영(Time-lapse imaging)을 통해 실험적 조작의 장기적인 결과에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

여기에서 우리는 수지상 돌기 네트워크가 정교해지는 4일 동안 매일 촬영한 미성숙 GFP 발현 뉴런을 볼 수 있습니다. 이 이미지들은 이광자 현미경을 사용하여 캡처되었으며 Z-축 투영(Z projection)으로 제시되었습니다. 신속한 타임랩스 이미징을 통해 수지상 돌기 사상돌기의 형성 및 퇴행을 포함하여 뉴런 성장의 보다 역동적인 과정의 특성을 관찰할 수 있습니다.

이 영상은 1시간 동안 2분 간격으로 3차원 이미징을 수행한, 비교적 성숙한 GFP 발현 뉴런을 보여줍니다. 다음은 1시간 동안 5분 간격으로 이미징한 미성숙 GFP 발현 뉴런의 예시입니다. 어린 뉴런은 매우 역동적이며 광범위한 분지 성장과 분지 수축을 보입니다.

GFP를 발현하는 이 뉴런의 확대 영상은 이 시스템의 발달 중인 뉴런에서 전형적으로 나타나는 수지상 돌기 필로포디아(filopodia)의 지속적인 생성과 회수 과정을 보여줍니다. 알비노 올챙이의 투명함과 뇌에 대한 접근성은 이 모델 시스템을 살아있는 유기체 내에서 뉴런의 성장과 세포 내 사건을 시각화하는 데 매우 이상적으로 만들어 줍니다. 단일 세포 전기천공법을 통해 우리는 단일 뉴런의 성장을 시각화하고, 그 외에는 변화가 없는 뇌 내에서 세포 자율적 조작을 수행할 수 있습니다.

지금까지 zebrafish 태아 극(TA poles)에서의 단일 세포 전기천공법 수행 방법을 살펴보았습니다. 본 영상에서는 TA poles의 전기천공법에 집중했지만, 이 기술은 다른 생물체뿐만 아니라 해마 절편 및 해리된 세포 배양에도 사용되어 왔습니다. 이 절차를 수행할 때는 높은 수율을 유지하기 위해 피펫 팁과 자극 파라미터를 지속적으로 수정하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.