지중해에서 칸디다 알비칸스 감염을 최적화하여 균류 발병기전과 숙주 방어 연구를 위한 프로토콜

저의 연구는 칸디다 알비칸 감염과 숙주 반응이 결과가 제거 또는 질병 진행에 어떻게 영향을 미치는지에 초점을 맞추고 있습니다. 주요 과제는 초기 곰팡이 감염에 대한 모델의 부재입니다. 이 프로토콜은 플라나리아를 다루기 쉽고 처리량이 높은 솔루션으로 사용합니다.

플라나리아 시스템은 질병의 시작, 진행, 제거, 치명성 연구를 가능하게 하며, 선천 면역 반응의 고해상도 측정을 가능하게 합니다. 우선, 입체현미경으로 약 5밀리미터 길이의 슈미트테아 지중해 플라나리아를 선별하고, 동물이 완전히 펼쳐진 후 측정합니다. 5밀리미터 미만의 플라나리아 렌즈는 모반 발달이나 불완전 발달 개체를 포함해 결과가 일관되지 않을 수 있으므로 피해야 합니다.

또한 5밀리미터 이상의 플라나리아는 제외해야 하는데, 큰 동물은 형광 면역 염색에 덜 적합하기 때문입니다. 배반 유래, 색소 침착이 부족한 조직, 또는 색소 침착이 불완전한 동물은 제외합니다. 모든 포함 기준을 충족하는 건강한 플라나리아를 조직 배양 처리되지 않은 6웰 폴리스티렌 플레이트의 우물당 2밀리리터의 신선한 플라나리아 물에 옮깁니다.

감염되지 않았거나 모조 처리된 동물로 구성된 음성 대조군과 야생형 칸디다 알비칸스에 감염된 동물로 구성된 양성 대조군에 대해 웰을 할당합니다. 각 우물의 모든 물을 제거하고 신선한 플라나리아 물 2밀리리터로 교체하여 우물 전체의 균일성을 유지하세요. 감염되기 전 하루 동안 동물들이 새로운 환경에서 균형을 이루도록 하세요.

6웰 플레이트를 기울이고 무균 기법으로 한 웰의 모든 물을 부드럽게 제거하세요. 다음 우물로 이동하기 전에 계산된 플라나리아 물과 칸디다 알비칸스 배양물을 즉시 우물에 추가하세요. 접종 날짜와 시간을 기록하세요.

접종된 6웰 플레이트를 어둡고 정적인 실온의 장소에 놓으세요. 플라나리아를 칸디다 알비칸과 함께 최대 72시간 동안 인큐베이팅하세요. 감염 후 24시간 후 첫 시점에 접시판을 약간 기울이세요.

그 후 멸균 이송 피펫을 사용해 칸디다 알비칸스 배양균이 포함된 액체를 흡인하고, 동물이 없는 우물 공간에 부드럽게 분사하여 침착된 곰팡이층을 혼합합니다. 이 과정을 우물당 5번에서 10번 반복하여 침착된 곰팡이층을 분해하고 플라나리아인과의 직접 접촉을 피하세요. 최상의 시야를 위해 재현수 단계 전후로 어두운 배경에 곰팡이 침착을 관찰하세요.

동일한 조건에서 감염되지 않은 통제정을 재현탁하세요. 감염 후 48시간에도 이 절차를 반복합니다. 감염 후 72시간 후, 플라나리아를 깨끗한 물 2밀리리터가 담긴 신선한 우물로 옮겨 최소한의 액체를 사용하여 곰팡이 전반을 최소화합니다.

동물을 옮기면 모든 물을 제거하고 신선한 플라나리아 물로 교체하세요. 감염 후 하루 후부터 숙주 결과 평가를 시작하여 원하는 실험적 평가 지점까지 매일 진행합니다. 표준화된 0에서 3 점수 체계를 사용해 숙주 피해를 정량화하세요.

감염 후 3일째에 플라나리아를 각 웰당 2밀리리터의 신선한 플라나리아 물이 담긴 새로운 6웰 플레이트에 부드럽게 옮기며, 잔류 곰팡이 배양 유입을 피합니다. 최소 10배 대의선으로 광학 현미경으로 동물을 관찰하세요. 표준화된 점수표를 사용해 호스트 결과를 기록하세요.

또한, 감염 및 제거 과정에서 숙주 상피에 곰팡이가 정착하는 것을 관찰하기 위해 항칸디다 면역염색을 시행할 수 있습니다. 감염 후 4일 후에는 진균 상피 정착이 현저히 감소했으며, 감염 7일째에는 거의 모든 표면 관련 곰팡이가 ID50 조건에서 제거되었습니다. 감염되지 않은 대조군은 전혀 증상이 없었다.

약 7.0 곱하기 10의 7제곱 칸디다 알비칸스 세포당 약 30%는 무증상, 50%는 증상, 20%는 사망했다. 약 8.0 곱하기 10의 7제곱 칸디다 알비칸스 세포 수당 약 30%는 무증상, 20%는 증상, 50%는 사망 상태였습니다. 중앙값 생존율은 7.0 곱하기 10에서 7개의 칸디다 알비칸스 세포 1제곱 제곱 배당 약 90%에서 약 50%로, 8.5 곱하기 10 곱셈 7 세포 10 제곱 제곱 배당 25% 미만으로 감소했습니다.

야생형 칸디다 알비칸에 감염된 플라나리아의 전체 생존율은 약 8.0 곱하기 10의 7 세포 10제곱 비율에서 약 50%였으며, 감염되지 않은 대조군에서는 100% 생존율을 기록했습니다. 이 프로토콜은 유전적으로 다루기 쉬운 숙주에서 영상과 분자 접근법을 통합하여 숙주-병원체 역학을 생체 내에서 연구할 수 있게 합니다. 향후 응용 분야로는 고처리량 돌연변이 선별, 미생물 종 간 비교 연구, 독성학 및 약물 효능 시험을 위한 적응 등이 포함됩니다.