간접 자기 구슬 전략을 이용한 포도플라닌 양성 중간엽 줄기세포 아군의 분리 및 검증

저희 연구는 고순도와 가독성을 갖춘 비용 효율적인 자기 구슬 연화를 위해 특정 중간엽 줄기세포 하위 집합을 분리하는 데 중점을 두었습니다. 이 프로토콜은 표준 PE 접합 항체를 사용하여 모든 막 단백질에 적용할 수 있습니다. 우선, 필요한 시약을 모으세요.

3번에서 5번 통로에서 80%에서 90%의 합류율에 도달한 간엽 줄기세포(MSC)를 선택한다. 배양 매체는 버리세요. 셀을 10밀리리터 미리 데워진 PBS로 두 번 세척하세요.

용기를 부드럽게 흔들고 PBS를 버리세요. 0.25% 트립신-EDTA 2밀리리터를 추가하고 37도 섭씨에서 3분에서 5분간 배양합니다. 현미경으로 세포가 둥글게 모여 분리될 때까지 관찰하세요.

트립신을 중화하기 위해 16.5% FBS가 함유된 배양지 4밀리리터를 추가합니다. 세포를 부드럽게 피펫으로 제거하여 완전히 분리시키고, 세포 현탁액을 15밀리리터 원심분리관으로 옮깁니다. 세포 현탁액을 300g에서 3분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.

세포 펠릿을 1밀리리터의 버퍼에 다시 현탁하세요. 셀 수를 세어 전체 셀 수를 결정하세요. 앞서 보인 대로 원심분리기를 하고 상청액을 버립니다.

세포를 완충제로 재현탁하여 밀리리터당 1억 세포의 밀도를 달성합니다. 셀 현탁액을 5밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮기세요. 1,000만 세포당 10마이크로리터의 Fc 감마 RII 차단제를 추가하세요.

부드럽게 섞고 실온에서 10분간 배양하세요. 1,000만 세포당 5마이크로리터의 피코에리트린 접합체(PE 접합체), 항인간 포도플라닌 또는 PDPN 항체를 추가하세요. 부드럽게 섞은 후 실온에서 15분에서 20분 정도 빛을 차단한 상태로 배양하세요.

1,000만 세포당 10마이크로리터의 선택 칵테일을 추가하세요. 부드럽게 섞고 실온에서 15분간 배양하세요. 와류 믹서를 사용해 자기 비즈 바이알을 30초간 세게 섞으세요.

1,000만 세포당 5마이크로리터의 자기 구슬을 추가하세요. 부드럽게 섞고 실온에서 10분간 배양하세요. 표지된 셀 샘플이 담긴 5밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브를 자기 분리 스탠드에 놓습니다.

튜브에 완충제를 넣어 전체 부피를 2.5에서 3밀리리터로 만듭니다. 그리고 실온에서 5분간 배양하세요. 자석과 튜브를 하나의 단위로 결합한 후, 뒤집어 상정액을 새로운 수집관에 부어줍니다.

수집한 PDPN 음성 세포 분획을 얼음 위에 올려놓습니다. 앞서 시연한 대로 자기 분리 과정을 세 번 반복하며, 각 분리 후 상정액을 동일한 PDPN 음수 분획 수집관에 부어줍니다. 최종 세척 후에는 자기적으로 결합된 PDPN 양극 세포 분획이 담긴 튜브를 자기 분리 스탠드에서 분리합니다.

양성 세포를 다시 현지시키기 위해 3밀리리터의 완충제를 추가하세요. 양성 분획 셀 현탁액을 신선하게 표지한 튜브로 옮깁니다. 양극과 음성의 세포 양을 모두 세어보세요.

각 분획마다 셀 수율을 기록하세요. 양분획 세포 현탁액을 3분간 3분간 원심분리하고 상정액을 버립니다. 세포 펠릿을 16.5% FBS가 포함된 MEM 알파 배양 배지에 재현탁합니다.

필요에 따라 세포 밀도를 조절하고 세포를 배양 배지 또는 플라스크에 씨앗 채우세요. 세포를 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양하세요. 세포를 세어본 후, 12밀리리터 배양지에 100밀리미터 배양 접시에 300만 개의 세포 밀도로 씨앗을 심습니다.

씨앗 후 24시간 후에 세포 부착 상태를 관찰하세요. 배양지를 신선한 배지로 교체하여 잔여 자기 구슬과 비부착 세포를 제거하세요. 트립신 추출로 세포를 채취하세요.

세포 현탁액을 부드럽게 위아래로 10에서 15번 피펫으로 움직여 자기 구슬과 잔류 항체를 제거하세요. 유세포분석을 통해 PDPN PE 양성 세포의 비율을 평가합니다. 로그 성장 단계에서 세포를 수집하세요.

세포를 96웰 플레이트에 씨앗 뿌리세요. 서로 다른 시점에 셀 카운팅 키트-8m 또는 CCK-8을 추가하고, 제조사 지침에 따라 시약을 하고 흡수도를 측정하세요. GraphPad Prism 소프트웨어에서 서로 다른 시점별 사전 정렬 및 정렬 후 데이터를 집계한 후, 데이터를 클릭해 증식 곡선을 그립니다.

FC 수용체 차단, 항체 표지, 자기 분리 후 최종 세포 수는 PDPN 양성 분획 약 350만 개, 음성 분획 640만 개였습니다. 자기 분류 이전에는 시작 세포 집단에서 PDPN 양성 세포의 빈도가 38.7%였으며, 정렬 후 양성 분획에는 97.9%의 PDPN PE 양성 세포가 포함되어 있었습니다. 음성 분획의 유세포분석 결과 PDPN 양성 세포의 4.30%가 남아 있어, 음성 분획에서 PDPN 양성 세포가 효율적으로 고갈되었음을 나타냈다.

3일 연속 배양 동안 PDPN 양성 세포의 증식 곡선은 분류되지 않은 MSC와 비교해 유의한 차이가 없었으며, 이는 분류 전략이 분류되지 않은 MSC에 비해 CCK-8 기반 증식이나 대사 활동에 눈에 띄는 감소를 일으키지 않았음을 나타냈다. 이 접근법은 높은 순도와 가독성을 가진 하위 집단을 연구할 수 있게 합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 고려사항은 세포 가독성을 유지하고 결합되지 않은 구슬을 제거하는 데 부드럽게 작용하는 것입니다.

이 절차를 따르면, 증식 분석, 퇴적 및 팽창 연구를 수행할 수 있습니다.