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본 연구는 Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011278), Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute 자체 펀딩 프로젝트 (GDBRI-ZL202602), 그리고 심혈관 질환 모델 및 병인에 관한 중국-캐나다 학술 교류 및 협력 (MS202500058)의 지원을 받아 수행되었습니다.

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	<li>Fauconnier, J., Meli, A. C., Thireau, J., Roberge, S., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+leak+mediated+by+caspase-8+activation+leads+to+left+ventricular+injury+after+myocardial+ischemia-reperfusion.">Ryanodine receptor leak mediated by caspase-8 activation leads to left ventricular injury after myocardial ischemia-reperfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13258-13263 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+a+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J Am Coll Cardiol. , (2000).</li><li>Liu, D., Tian, X., Liu, Y., Song, H., Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREG+ameliorates+the+phenotypic+switching+of+cardiac+fibroblasts+after+myocardial+infarction+via+modulation+of+CDC42.">CREG ameliorates the phenotypic switching of cardiac fibroblasts after myocardial infarction via modulation of CDC42.</a> Cell Death Dis. 12 (4), (2021).</li><li>Contessotto, P., Pandit, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+to+prevent+post-infarction+remodelling:+from+repair+to+regeneration.">Therapies to prevent post-infarction remodelling: from repair to regeneration.</a> Biomaterials. 275, (2021).</li><li>Zhu, R., Sun, H., Yu, K., Zhong, Y., Shi, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-37+and+dendritic+cells+treated+with+interleukin-37+plus+troponin+I+ameliorate+cardiac+remodeling+after+myocardial+infarction.">Interleukin-37 and dendritic cells treated with interleukin-37 plus troponin I ameliorate cardiac remodeling after myocardial infarction.</a> J Am Heart Assoc. 5 (12), (2016).</li><li>Chang, Y., Zhang, J., Huo, X., Qu, X., Xia, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+rigidity+dictates+colorectal+tumorigenic+cell+stemness+and+metastasis+via+CRAD-dependent+mechanotransduction.">Substrate rigidity dictates colorectal tumorigenic cell stemness and metastasis via CRAD-dependent mechanotransduction.</a> Cell Rep. 38 (7), (2022).</li><li>Seo, Y., Jang, J., Ko, K. P., Zou, G., Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dysregulation+induces+immune+evasion+via+oxidative+stress-activated+PD-L1+in+gastric+cancer.">Actin dysregulation induces immune evasion via oxidative stress-activated PD-L1 in gastric cancer.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Kim, B., Zhang, S., Huang, Y., Ko, K. P., Jung, Y. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRACD+loss+induces+neuroendocrine+cell+plasticity+of+lung+adenocarcinoma.">CRACD loss induces neuroendocrine cell plasticity of lung adenocarcinoma.</a> Cell Rep. 43 (6), (2024).</li><li>Jung, Y. S., Wang, W., Jun, S., Zhang, J., Srivastava, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+CRAD-controlled+cytoskeleton+initiates+mucinous+colorectal+cancer+via+&#946;-catenin.">Deregulation of CRAD-controlled cytoskeleton initiates mucinous colorectal cancer via &#946;-catenin.</a> Nat Cell Biol. 20 (11), 1303-1314 (2018).</li><li>Liu, Z., Cao, H., Shi, Y., Yang, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIAA1211+plays+an+oncogenic+role+in+human+non-small+cell+lung+cancer.">KIAA1211 plays an oncogenic role in human non-small cell lung cancer.</a> J Cancer. 10 (26), 6747-6753 (2019).</li><li>Snider, P. L., Snider, E., Simmons, O., Lilly, B., Conway, S. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uncharacterized+mKiaa1211+expression+during+mouse+development+and+cardiovascular+morphogenesis.">Analysis of uncharacterized mKiaa1211 expression during mouse development and cardiovascular morphogenesis.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 6 (2), (2019).</li><li>Lin, Y. H., Warren, C. M., Li, J., McKinsey, T. A., Russell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibril+growth+during+cardiac+hypertrophy+is+regulated+through+dual+phosphorylation+and+acetylation+of+the+actin+capping+protein+CapZ.">Myofibril growth during cardiac hypertrophy is regulated through dual phosphorylation and acetylation of the actin capping protein CapZ.</a> Cell Signal. 28 (8), 1015-1024 (2016).</li><li>Yang, F. H., Pyle, W. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cardiac+CapZ+protein+protects+hearts+against+acute+ischemia-reperfusion+injury+and+enhances+preconditioning.">Reduced cardiac CapZ protein protects hearts against acute ischemia-reperfusion injury and enhances preconditioning.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (3), 761-772 (2012).</li><li>Tong, C., Huang, G., Ashton, C., Wu, H., Yan, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+cost-effective+gene+targeting+in+rat+embryonic+stem+cells+by+TALENs.">Rapid and cost-effective gene targeting in rat embryonic stem cells by TALENs.</a> J Genet Genomics. 39 (6), 275-280 (2012).</li><li>Cordes, S. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-ethyl-N-nitrosourea+mutagenesis:+boarding+the+mouse+mutant+express.">N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis: boarding the mouse mutant express.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69 (3), 426-439 (2005).</li><li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Kanke, K. L., Rayner, R. E., Bozik, J., Abel, E., Venugopalan, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+with+internal+base+modifications+mediates+highly+efficient+knock-in+in+primary+cells+using+CRISPR-Cas9.">Single-stranded DNA with internal base modifications mediates highly efficient knock-in in primary cells using CRISPR-Cas9.</a> Nucleic Acids Res. 52 (22), 13561-13576 (2024).</li><li>Mihos, C. G., Liu, J. E., Anderson, K. M., Pernetz, M. A., O'Driscoll, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speckle-tracking+strain+echocardiography+for+the+assessment+of+left+ventricular+structure+and+function:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Speckle-tracking strain echocardiography for the assessment of left ventricular structure and function: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 152 (10), (2025).</li><li>Garg, P. K., Biggs, M. L., Kizer, J. R., Shah, S. J., Psaty, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+dysregulation+and+subclinical+cardiac+dysfunction+in+older+adults:+the+Cardiovascular+Health+Study.">Glucose dysregulation and subclinical cardiac dysfunction in older adults: the Cardiovascular Health Study.</a> Cardiovasc Diabetol. 21 (1), (2022).</li><li>Asanuma, T., Fukuta, Y., Masuda, K., Hioki, A., Iwasaki, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+myocardial+ischemic+memory+using+speckle+tracking+echocardiography.">Assessment of myocardial ischemic memory using speckle tracking echocardiography.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 5 (1), 1-11 (2012).</li><li>Chong, S. Y., Zharkova, O., Yatim, S. M. J. M., Wang, X., Lim, X. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+cytoplasmic+domain+exacerbates+post-infarct+left+ventricular+remodeling+via+orchestrating+cardiac+inflammation+and+angiogenesis.">Tissue factor cytoplasmic domain exacerbates post-infarct left ventricular remodeling via orchestrating cardiac inflammation and angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (19), 9243-9261 (2021).</li><li>Hung, C. L., Verma, A., Uno, H., Shin, S. H., Bourgoun, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+and+circumferential+strain+rate,+left+ventricular+remodeling,+and+prognosis+after+myocardial+infarction.">Longitudinal and circumferential strain rate, left ventricular remodeling, and prognosis after myocardial infarction.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1812-1822 (2010).</li><li>Labuhn, M., Adams, F. F., Ng, M., Knoess, S., Schambach, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+sgRNA+efficacy+prediction+improves+large-+and+small-scale+CRISPR-Cas9+applications.">Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications.</a> Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).</li><li>Wu, J., Bu, L., Gong, H., Jiang, G., Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+heart+rate+and+anesthetic+timing+on+high-resolution+echocardiographic+assessment+under+isoflurane+anesthesia+in+mice.">Effects of heart rate and anesthetic timing on high-resolution echocardiographic assessment under isoflurane anesthesia in mice.</a> J Ultrasound Med. 29 (12), (2010).</li><li>Voigt, J. U., Pedrizzetti, G., Lysyansky, P., Marwick, T. H., Houle, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+for+a+common+standard+for+2D+speckle+tracking+echocardiography:+consensus+document+of+the+EACVI/ASE/Industry+Task+Force+to+standardize+deformation+imaging.">Definitions for a common standard for 2D speckle tracking echocardiography: consensus document of the EACVI/ASE/Industry Task Force to standardize deformation imaging.</a> J Am Soc Echocardiogr. 28 (2), 183-193 (2015).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. 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M., Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>R&#246;sner, A., Barbosa, D., Aars&#230;ther, E., Kj&#248;n&#229;s, D., Schirmer, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+frame+rate+on+two-dimensional+speckle-tracking+strain+measurements:+a+study+on+silico-simulated+models+and+images+recorded+in+patients.">The influence of frame rate on two-dimensional speckle-tracking strain measurements: a study on silico-simulated models and images recorded in patients.</a> Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16 (10), 1137-1147 (2015).</li><li>Argiro, A., Bui, Q., Hong, K. N., Ammirati, E., Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+gene+therapy+in+cardiomyopathies.">Applications of gene therapy in cardiomyopathies.</a> JACC Heart Fail. 12 (2), 248-260 (2024).</li><li>Micheletti, R., Plaisance, I., Abraham, B. J., Sarre, A., Ting, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Wisper+controls+cardiac+fibrosis+and+remodeling.">The long noncoding RNA Wisper controls cardiac fibrosis and remodeling.</a> Sci Transl Med. 9 (395), (2017).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Juliano, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+therapeutic+oligonucleotides.">The delivery of therapeutic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6518-6548 (2016).</li></ol>

저자들은 상충하는 이해관계가 없음을 밝힙니다.

본 연구에서 우리는 CRISPR/Cas9 기술로 공학적으로 설계된 Cracd 결핍 마우스를 제작하였으며, 일반 심초음파, 스펙클 추적 변형 영상(speckle‑tracking strain imaging) 및 조직학적 분석을 통해 심근경색(MI) 후 표현형을 분석하는 워크플로우를 수립하였습니다. 해당 프로토콜을 통해 CRACD 단백질의 소실이 확인된 녹아웃(knockout) 마우스를 제작하였습니다. Cracd 결핍 마우스는 심근경색 후 야생형(WT) 대조군에 비해 심실 확장이 적고, 박출률(EF)이 더 높으며, 섬유화가 감소한 것으로 나타나 심장 리모델링 연구를 위한 해당 모델의 유용성을 확인하였습니다.
이 모델의 성공은 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. gRNA 설계 및 인 비트로(in vitro) 검증은 접합자 편집 효율에 직접적인 영향을 미칩니다.23CRISPick 또는 Benchling을 사용하여 CRISPRater 점수가 0.5 이상인 gRNA를 선택한 다음, in vitro Cas9/gRNA 분석을 통해 절단 효율을 테스트합니다. 다음의 성과를 거둔 gRNA만 &#62; 50% 절단편을 미세주입합니다. 적절한 좌전하행동맥(LAD) 결찰 또한 매우 중요합니다. 우심실을 천공(너무 깊음)하거나 혈관을 폐쇄하지 못하는(너무 얕음) 상황을 방지하기 위해, 7-0 봉합사는 LAD 기시점에서 2~3mm 떨어진 지점에서 0.5~1mm 깊이로 통과해야 합니다. 전벽이 즉각적으로 하얗게 변하면 폐쇄가 확인된 것입니다. 심초음파 검사 중 심박수 조절 또한 필수적입니다.24이소플루레인(통상 1~2%)을 조절하여 450~550 bpm을 유지하면 일반 측정 및 변형률(strain) 측정의 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 마지막으로, 스펙클 추적(speckle‑tracking) 분석의 경우 색상으로 표시된 메쉬(mesh)의 시각적 평가가 필수적입니다.25메시는 급격한 변화 없이 심근 경계를 따라야 하며, 그렇지 않을 경우 수동 보정이 필요합니다. 세 번의 시도 후에도 품질이 여전히 낮은 경우, 해당 마우스는 분석에서 제외합니다.
프로토콜을 세심하게 따르더라도 특정 기술적 어려움이 발생할 수 있습니다. 체계적인 문제 해결(troubleshooting)을 통해 대부분의 문제를 해결할 수 있습니다. 낮은 생식세포 전달률(10% 미만)은 보통 공여체 올리고뉴클레오타이드의 통합 부전이나 약한 gRNA 활성도를 나타냅니다26. 따라서 공여체 oligo 농도를 20 ng/µL로 높이고, 상동 팔(homology arms)의 길이를 120–200 bp로 연장하며, gRNA 절단 효율(&#62; 50%)을 재확인하면 전달률을 개선할 수 있습니다. 높은 MI 후 사망률(30% 초과)은 주로 기흉, 출혈 및 광범위한 경색으로 인해 발생합니다27. 그러므로 마우스가 깰 때까지 지속적으로 산소를 공급하고 가열 패드를 사용하여 체온을 유지하면 사망률을 눈에 띄게 낮출 수 있습니다. 결찰 후 전벽이 창백해지지 않는다면, LAD를 잘못 식별했거나 봉합 깊이가 너무 얕을 가능성이 높습니다. 이 경우 LAD(밝은 붉은색의 대각선 혈관)의 위치를 다시 확인하고, 때로는 해부 현미경을 사용하여 바늘을 0.5–1 mm 깊이로 다시 통과시키면 이 문제가 해결됩니다. 스펙클 추적(speckle-tracking) 품질이 낮은 경우, 낮은 프레임 레이트, 흐릿한 경계 또는 움직임 아티팩트가 일반적인 원인입니다28. 따라서 프레임 레이트를 높이고, 게인(gain)을 미세 조정하며, 심내막 추적선을 수동으로 교정하고, 부정맥이 있는 사이클을 제외하는 것이 도움이 됩니다.
이러한 운영상의 고려 사항 외에도, 본 방법에는 분명한 한계가 있습니다. Cracd 녹아웃은 전신적으로 이루어지므로 모든 조직에서 CRACD가 결핍됩니다. 결과적으로, 전신적 기여가 영향을 미쳤을 수 있으므로 관찰된 보호 효과를 심근세포만의 작용으로만 돌릴 수는 없습니다. 세포 유형별 역할을 구분하기 위해서는 조건부 녹아웃이 필요할 것입니다. 또 다른 한계는 7일 차라는 단일 시점 측정으로 인해 만성 리모델링에 관한 정보를 알 수 없다는 점입니다. 따라서 장기 연구를 위해서는 더 후기 시점(4주 또는 8주)을 추가해야 합니다. 재현성 또한 이미지 품질에 의존한다는 점이 걸림돌입니다. 모든 초음파 시스템이 깨끗한 심내막 경계를 제공하는 것은 아니며, 작업자의 숙련도가 중요합니다. 따라서 전문 교육을 받은 사람이 모든 수술과 측정을 수행하는 것을 권장합니다.
이러한 한계점을 고려할 때, 본 연구의 접근 방식을 심근경색(MI) 후 리모델링 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위한 대안적 전략들과 비교하는 것이 유용합니다. AAV 매개 유전자 조작과 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASOs)가 일반적인 두 가지 대안입니다29,30. AAV9은 교배 과정 없이 심장 특이적인 일시적 과발현 또는 넉다운을 유도할 수 있으나, 패키징 용량 제한(~4.7 kb), 가변적인 형질전환 효율, 그리고 오프 타겟 효과(off-target effects)가 단점으로 꼽힙니다31. 이와 대조적으로, 본 연구의 CRISPR/Cas9 넉아웃 모델은 영구적이고 완전한 기능 상실을 제공하므로 장기 연구에 유리합니다. ASOs는 가역적이고 용량 의존적인 넉다운을 빠르게 유도하여 급성 중재 연구에 적합하지만, 반복적인 투여가 필요하며 조직 특이성이 부족하다는 단점이 있습니다32. 따라서 본 논문에서 기술한 구성적 넉아웃(constitutive knockout) 방식이 초기 발견 및 만성 표현형 분석에 가장 적합합니다.
마지막으로, 본 프로토콜은 CRACD 이외의 범위로 충분히 확장 가능합니다. CRISPR/Cas9를 이용한 유전자 결손 마우스 제작과 심초음파 검사, strain imaging 및 조직학적 분석을 결합한 동일한 워크플로우를 통해 MI 후 리모델링 과정의 모든 후보 유전자를 평가할 수 있습니다. 이러한 표현형 분석 프레임워크는 횡대동맥 결찰(압력 과부하) 또는 허혈-재관류 손상과 같은 다른 심혈관 질환 모델에도 적합합니다. 또한, 본 프로토콜을 통해 얻은 조직 샘플은 분자적 메커니즘을 밝히기 위한 멀티오믹스 분석(전사체학, 단백질체학, 대사체학)에 활용될 수 있습니다. Cracd 결핍 모델은 약물 테스트 도구로 활용될 수 있으며, CRACD 경로를 통해 작용할 것으로 추정되는 화합물들을 평가할 수 있습니다. 따라서 본 프로토콜은 심혈관 연구의 광범위한 기전 및 중개 연구에 적용 가능한 플랫폼을 제공합니다.

심근경색(MI)은 전 세계적으로 주요한 이환율 및 사망률의 원인으로 남아 있으며, 전 세계 심혈관 건강에 상당한 부담을 주고 있습니다1. MI 이후의 장기 예후는 주로 좌심실(LV) 리모델링 과정에 의해 결정되는데2, 여기에는 심실 확장, 벽 얇아짐 및 간질성 섬유화가 포함되며3,4, 이는 심부전(HF)으로 진행되는 핵심 요인이 됩니다. MI 후 심장 리모델링으로 인한 심부전의 전 세계적 발생률은 심혈관 질환의 부담을 더욱 가중시킵니다5. 이러한 잘 확립된 임상적 관찰에도 불구하고, 민감하고 재현 가능한 생체 내(in vivo) 모델을 사용하여 MI 후 리모델링에서 특정 유전자의 역할을 평가하는 체계적인 연구가 부족한 실정입니다. 현재 CRISPR/Cas9로 제작된 녹아웃 모델과 고급 스트레인 영상 기술을 결합하여 CRACD와 같은 세포골격 조절 인자를 평가하는 프로토콜은 없습니다. 따라서 정밀한 유전자 조작과 고해상도 심장 표현형 분석이 가능한 방법이 시급히 필요합니다.
KIAA1211로도 알려진 Capping protein inhibiting regulator of actin dynamics (CRACD)는 주로 세포질에 위치하며 세포골격 역학에서 중요한 역할을 하는 액틴 중합 조절 인자입니다6. 이는 액틴 캡핑 단백질(CAPZA1, CAPZA2, CAPZB)과 결합하여 액틴 필라멘트의 barbed end에 캡핑되는 것을 방지함으로써 액틴 중합을 긍정적으로 조절합니다7. 상피 조직에서 CRACD는 액틴 세포골격의 무결성을 유지함으로써 세포 형태와 신호 전달을 유지하는 데 결정적인 역할을 합니다8,9. 종양 세포의 경우, CRACD의 조절 이상은 세포 전이 및 증식의 강화와 관련이 있습니다6,10. 심장에서의 CRACD 역할은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 심장 전사체 및 실험적 개입 연구에 따르면 Cracd 유전자 발현은 병리적 스트레스에 반응하며, 심실 리모델링 동안 세포골격 역학과 관련된 유전자들을 조절할 수 있습니다9,11. 또한, CRACD의 억제 단백질인 CapZ는 심장 병리와 밀접하게 연관되어 있는데, CapZ의 인산화는 페닐에프린(phenylephrine)에 의해 유도된 비대에 따른 근원섬유의 성장을 조절합니다12. 본 연구진의 초기 연구 결과, CRACD의 적절한 하향 조절은 급성 허혈 이후 심근 손상을 보호하고 근필라멘트 수축력을 유지시키는 것으로 나타났습니다13. 이러한 발견은 CRACD가 심근경색(MI) 후 부적응성 심실 리모델링에서 역할을 할 가능성을 제기합니다. 그러나 Cracd 결핍이 심근경색 후 리모델링을 조절하는지 테스트하는 체계적인 in vivo 기능 상실 연구는 부족했으며, 이는 주로 허혈성 스트레스 하에서 Cracd 결핍 마우스를 생성하고 표현형을 분석하기 위한 검증된 단계별 프로토콜이 없었기 때문입니다.
구성적 녹아웃 마우스를 제작하기 위한 여러 가지 접근 방식이 존재합니다. 배아줄기(ES) 세포를 이용한 전통적인 상동 재조합 방식은 정밀하지만 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리며(12~18개월), 특정 마우스 계통으로 제한된다는 단점이 있습니다14. ENU (N‑ethyl‑N‑nitrosourea) 돌연변이 유발 방식은 무작위 점 돌연변이를 생성하므로 광범위한 역교배와 시퀀싱이 필요합니다15. 이와 대조적으로, CRISPR/Cas9은 본 연구에서 다음과 같은 뚜렷한 실무적 이점을 제공합니다: (i) 접합자에 직접 주입함으로써 제작 기간을 4~6개월로 단축할 수 있습니다; (ii) 큰 게놈 단편(3153 bp)을 결실시켜 완전한 기능 상실을 보장할 수 있습니다; (iii) 계통 전환 없이 C57BL/6N 배경에서 직접 작동합니다; (iv) 선택 마커를 사용하지 않아 의도치 않은 전사 간섭을 최소화합니다. 따라서 CRISPR/Cas9은 일상적인 심혈관 표현형 분석에 적합한 Cracd 결핍 라인을 제작하는 데 가장 효율적인 선택입니다. 이 기술은 정밀한 in vivo 기능 상실 연구를 수행하는 데 널리 사용되어 왔습니다16,17.
스펙클 추적 변형 영상법(Speckle-tracking strain imaging)은 심근 내 천연 음향 스펙클의 움직임을 프레임별로 추적하는 후처리 기술로, 변형률(strain, 길이의 분율 변화) 및 변형률 속도(strain rate, 변형 속도)와 같은 심근 변형 파라미터를 계산할 수 있게 합니다18. 전반적인 기능 지표(박출률, 분율 단축률, 좌심실 내경)를 제공하며 국소 벽 운동 이상에 상대적으로 둔감한 기존의 M-모드 또는 2차원 심초음파와 달리, 변형 영상법은 분절적 수축 기능을 정량화할 수 있습니다. 이는 특히 경색 후 초기 단계에서 중요한데, 이 시기에는 유의미한 국소 기능 장애에도 불구하고 비경색 분절의 보상적 과운동성으로 인해 전반적인 박출률이 유지될 수 있기 때문입니다. 스펙클 추적법은 표준 평가지표보다 몇 가지 장점을 제공합니다. 즉, 분절 변형률 및 변형률 속도, 변위, 속도를 산출하여 미세한 아임상적 변화를 감지할 수 있으며19, 비가역적 리모델링이 발생하기 전의 비동기화 및 초기 수축 결손을 식별할 수 있고, 허혈에 가장 취약한 층인 심내막하층을 직접 조사할 수 있습니다20. 본 연구에서 CRACD는 미세 수준에서 근섬유 수축력에 영향을 줄 수 있는 세포골격 조절자입니다. 기존의 심강 기반 측정법으로는 이러한 국소적 기계적 효과를 놓치기 쉽습니다. 따라서 본 프로토콜에 스펙클 추적 분석을 통합함으로써 Cracd 결핍의 초기 보호 효과를 감지하는 능력을 향상시킬 수 있습니다. 이에 따라, 본 프로토콜에 스펙클 추적법을 통합하는 것은 특히 초기 확장과 수축 기능 장애가 나타나는 MI 후 첫 일주일 동안 경색 후 리모델링을 평가하기 위한 민감하고 정량적인 도구를 제공합니다21,22.
본 프로토콜은 구성적 녹아웃(constitutive knockout)과 고해상도 이미징의 조합을 사용하여 특정 유전자 결손이 심근경색(MI) 후 급성(7일) 리모델링에 미치는 기능적 영향을 조사하는 연구자를 위해 설계되었습니다. 이는 표적 유전자의 전신 결손이 허용되며, 주요 평가 지표가 초기 수축 기능 및 구조적 변화인 가설 생성 연구에 적합합니다. 하지만 몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 첫째, Cracd 결핍 마우스는 전신 녹아웃 모델이므로, 전신적 기여가 작용했을 가능성이 있어 관찰된 심장 보호 효과를 오로지 심근세포 내 CRACD의 결손 덕분이라고만 단정할 수 없습니다. 심장 특이적 결손을 달성하기 위해서는 향후 조건부 녹아웃(conditional knockout) 전략을 이용한 연구가 필요할 것입니다. 둘째, 본 프로토콜은 단일 시점(7일째)에 집중하고 있으며, 만성 리모델링이나 심부전(HF) 진행 과정은 다루지 않습니다. 급성기 이후의 종단적 연구가 요구됩니다. 셋째, 스펙클 추적 분석(speckle‑tracking analysis)은 고품질 이미지(명확한 심내막 경계)와 전용 소프트웨어가 필요하며, 이는 모든 핵심 시설에서 제공되지 않을 수 있습니다. 이러한 제한 사항에도 불구하고, 본 프로토콜은 심근경색 후 심장 리모델링에 관여하는 유전자의 초기 기능적 특성을 규명하기 위한 견고하고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.
본 연구는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 다음을 생성하고 검증하는 것을 목표로 하였다. Cracd-결핍 마우스 모델 (C57BL/6N-Cracd(d)em1 (c.538-83 ~ c.3352+255 결실)) ~의 영향을 조사하기 위해 Cracd 심근경색 후 심장 리모델링 및 심실벽 운동에 미치는 결핍의 영향. 야생형(WT, C57BL/6N) 및 Cracd-결핍 생쥐를 사용하였으며, 심근경색(MI) 1주일 후 종합적인 평가를 수행하였다. 평가 항목에는 일반적인 심초음파 파라미터, 스펙클 추적 변형 분석 및 조직병리학적 평가가 포함되었다. 우리는 초기 리모델링 사건을 포착하고 다음 사항을 결정하기 위해 심근경색 후 초기 단계(7일 차)에 특히 주목하였다. Cracd 결핍은 심근경색(MI)의 급성기 동안 심실 확장과 수축 기능에 영향을 미칩니다. 이러한 결과는 심근경색 후 유해한 심장 리모델링을 조절하는 데 있어 CRACD의 역할에 대한 가치 있는 통찰력을 제공할 것으로 기대됩니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CRISPR/Cas9&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma 염산염 용액</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T2663</td><td>DNA 추출 완충액 제조에 사용됨</td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>539480</td><td>마우스 꼬리 소화에 사용됨</td></tr><tr><td>그린 Taq 믹스</td><td>Vazyme, 중국</td><td>P131</td><td>PCR 증폭에 사용됨</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>BioFroxx, 독일</td><td>1110GR500</td><td>1% DNA 겔 전기영동에 사용됨&amp;ndash;2% 농도</td></tr><tr><td>DNA 마커</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>SM0242</td><td>PCR 생성물의 크기 측정을 위한 DNA 사다리로 사용됨</td></tr><tr><td>TIANamp Genomic DNA Kit</td><td>Tiangen Biotech, 중국</td><td>DP304</td><td>마우스 꼬리 조직에서 게놈 DNA를 추출하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>MEGAshortscript&amp;trade; T7 전사 키트</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>AM1354</td><td>gRNA의 인비트로(in vitro) 전사에 사용됨</td></tr><tr><td>RNA 정제 키트</td><td>Zymo Research, USA</td><td>R1016</td><td>전사된 gRNA 정제에 사용됨</td></tr><tr><td>BeyoCRISPR&amp;trade; sgRNA 스크리닝 키트</td><td>Beyotime, 중국</td><td>D8412S</td><td>gRNA 절단 활성의 인비트로(in vitro) 평가에 사용됨</td></tr><tr><td>RNase 억제제</td><td>NEB, USA</td><td>M0314</td><td>인비트로(in vitro) 전사 과정 중 RNA 분해를 방지하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>TaKaRa Taq</td><td>Takara Bio, 일본</td><td>R001A</td><td>마우스 꼬리 DNA의 PCR 유전자형 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>FERTIUP&amp;reg; 마우스 정자 사전 배양 배지: PM</td><td>Cosmo Bio, 일본</td><td>KYD-002-EX</td><td>체외 수정을 위한 정자 수정능 획득 유도에 사용됨</td></tr><tr><td>T7 ARCA mRNA 키트</td><td>NEB, USA</td><td>E2060</td><td>Cas9 mRNA의 인비트로(in vitro) 전사에 사용됨</td></tr><tr><td>임신마 혈청 성선자극호르몬</td><td>MCE, USA</td><td>9002-70-4</td><td>과배란 유도에 사용되며, 복강 내 주사로 투여함</td></tr><tr><td>인간 융모성 성선 자극 호르몬</td><td>ProSpec, 이스라엘</td><td>HOR-250</td><td>배란 유도를 위해 사용하며, 복강 내 주사로 투여함</td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td>Aladdin, 중국</td><td>R665526</td><td>RNA 용해 및 PCR 설정에 사용됨</td></tr><tr><td>프라이머</td><td>Sangon Biotech, 중국</td><td>/</td><td>유전자형 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;수술&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루레인</td><td>RWD Life Science, 중국</td><td>R510-22-10</td><td>수술 중 마취 유도 및 유지에 사용됨</td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>브(Veet), 프랑스</td><td>1000207</td><td>수술 및 초음파 검사 전 털 제거를 위해 흉부 부위에 적용함</td></tr><tr><td>7-0 봉합사</td><td>중국 링차오</td><td>LQ7022380206</td><td>좌전하행(LAD) 관상동맥의 영구 결찰에 사용됨</td></tr><tr><td>4-0 봉합사</td><td>중국 링차오</td><td>제공된 텍스트가 없어 번역을 수행할 수 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주시기 바랍니다.</td><td>수술 후 피부 절개 부위를 봉합하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>마취 호흡기</td><td>Harvard Apparatus, USA</td><td>테이블탑</td><td>이소플루란 전달 및 호흡 보조에 사용됨</td></tr><tr><td>소동물 인공호흡기</td><td>중국 타이멍</td><td>HX-101E</td><td>개흉술 중 양압 환기를 제공하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>정온 가열 패드</td><td>TigerGene, USA</td><td>TG-TP-GS</td><td>수술 및 회복 중 마우스의 체온을 유지하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>늑골 견인기</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, 중국</td><td>LN-18-4101</td><td>늑골을 분리하고 LAD 결찰을 위해 심장을 노출시키는 데 사용됨</td></tr><tr><td>가위</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, 중국</td><td>18-0551</td><td>피부 절개 및 조직 절단에 사용됨</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon, 일본</td><td>SMZ 745</td><td>LAD 동맥 결찰 수술 중 확대된 시야를 제공하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>미세수술용 지침기</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, 중국</td><td>18-2211</td><td>현미경 하에서 작은 7-0 봉합사를 끼운 바늘을 조작하는 데 사용함</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;화학 물질 및 시약&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>초음파 커플링제</td><td>Tianjin Jinya Technology Development, 중국</td><td>TM-100</td><td>심초음파 검사를 위해 흉부에 도포하여 프로브가 적절하게 접촉되도록 합니다.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>V900894</td><td>채취 후 심장 조직 고정에 사용됨</td></tr><tr><td>자일렌</td><td>맥클린, 중국</td><td>1330-20-7</td><td>염색 전 파라핀 제거 및 조직 투명화에 사용됨</td></tr><tr><td>헤마톡실린</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3136</td><td>HE 염색에 사용되는 핵 염색제,</td></tr><tr><td>에오신</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E4009</td><td>HE 염색에 사용되는 세포질 염색제,</td></tr><tr><td>폰소 S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3504</td><td>세포질 염색을 위한 Masson 염색에 사용됨</td></tr><tr><td>인몰리브덴산</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>221856</td><td>Masson 염색에서 매염제 및 분별제로 사용됨</td></tr><tr><td>아닐린 블루 용액</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>415049</td><td>콜라겐 섬유 염색(청색)을 위한 Masson 염색에 사용됨</td></tr><tr><td>CRACD 항체</td><td>압세아, 중국</td><td>KC-35356</td><td>Western Blot을 이용한 CRACD 단백질 검출용 1차 항체, 희석 배수 1:2000</td></tr><tr><td>GAPDH 항체</td><td>CST, 미국</td><td>2118S</td><td>Western Blot용 로딩 컨트롤 항체, 희석 배수 1:5000</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>맥클린, 중국</td><td>64-17-5</td><td>탈수 및 시약 조제용(70%, 80%, 95%, 100% 등급)으로 사용됨</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;실험 장비&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&amp;trade; 범례&amp;trade; Micro 17 원심분리기</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>75002541</td><td>일상적인 시료 준비에 사용됨</td></tr><tr><td>PCR 열 순환기</td><td>Bio-Rad Laboratories, USA</td><td>1861096</td><td>DNA 증폭에 사용됨</td></tr><tr><td>미세주입 시스템</td><td>Eppendorf, 독일</td><td>5193000020</td><td>배아(zygotes) 내로 CRISPR/Cas9 시약을 미세주입(microinjection)하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Vevo 2100 영상 시스템</td><td>VisualSonics, 캐나다</td><td>Vevo2100</td><td>심근경색(MI) 후 심장 기능 및 구조의 비침습적 평가를 위한 고주파 영상 시스템</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Leica, 독일</td><td>DM2500</td><td>HE 및 Masson 염색된 심장 절편 관찰에 사용됨</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;분석 소프트웨어&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>미국 국립보건원</td><td>/</td><td>면적 측정, 신호 정량화 및 조직학적 이미지(HE 및 Masson 염색) 처리를 포함한 이미지 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>VevoLab 3.2.0 / VevoStrain</td><td>VisualSonics, 캐나다</td><td>/</td><td>심장 기능 분석용 VevoLab 소프트웨어; 심근 스트레인 분석을 통해 심근경색(MI) 후 심장 성능을 평가하는 데 사용되는 VevoStrain 모듈</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>/</td><td>통계 분석 및 그래프 작성에 사용됨</td></tr></tbody></table>

심근경색 후 리모델링 연구를 위한 crispr/cas9 공학 기반 cracd 결핍 마우스 모델의 생성 및 표현형 특성 분석

Generation and Phenotypic Characterization of a CRISPR/Cas9-Engineered Cracd-Deficient Mouse Model for Post-Myocardial Infarction Remodeling Studies

Myocardial infarction (MI) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide. This protocol describes a method for generating and characterizing a Cracd-deficient mouse line on the C57BL/6N background using CRISPR/Cas9 technology. Zygotes were co-injected with Cas9 mRNA, a gRNA construct, and a donor template designed to generate a 3153-bp genomic deletion. The edited allele was confirmed by PCR genotyping and Sanger sequencing. To assess the functional role of CRACD in post-MI remodeling, Cracd-deficient and wild-type (WT, C57BL/6N) mice underwent MI induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. On postoperative day 7, cardiac function and left ventricular wall motion were assessed using transthoracic echocardiography and speckle-tracking strain imaging, followed by histopathological evaluation with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Representative results showed that Cracd-deficient mice exhibited reduced ventricular dilation and preserved systolic function compared to WT controls. This protocol provides a reliable experimental platform for mechanistic studies of CRACD in cardiac pathophysiology.

Generation of Cracd-deficient mice
A heritable mouse model carrying a targeted deficiency in the Cracd gene was generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing (Figure 1A, Figure 1B). To distinguish WT, heterozygous, and homozygous genotypes, a multiplex PCR was performed using three primers (F1, F2, R1) in a single reaction. Mice homozygous for the deletion (Cracd&#8209;deficient) displayed only the 421 bp band, WT mice showed only the 357 bp band (Figure 1C). Sanger sequencing of genomic DNA from Cracd-deficient mice confirmed the predicted deletion in the target gene compared to WT controls (Figure 1D). Western blot analysis further demonstrated a marked reduction in CRACD protein levels in cardiac tissues from Cracd-deficient mice compared with WT controls (Figure 1E). Together, these data confirm the successful establishment of the Cracd-deficient mouse line.
Echocardiography
Echocardiographic assessment on postoperative day 7 revealed pronounced pathological cardiac remodeling in WT mice after MI (WT-MI) compared with sham-operated controls (Figure 2A). The WT-MI group showed thinning of the interventricular septum (Figure 2B, C), significant left ventricular (LV) dilation as reflected by increased LVIDd (Figure 2D) and LVIDs (Figure 2E), and thinning of the posterior wall (Figure 2F, G). These structural alterations were associated with a pronounced decline in global systolic function, as demonstrated by significantly reduced EF (Figure 2H) and FS (Figure 2I). In contrast, Cracd-deficient mice displayed a cardioprotective phenotype following MI. LV dilation was significantly attenuated, with notably smaller LVIDd and LVIDs compared with the WT-MI group. Furthermore, these mice exhibited improved systolic thickening of the posterior wall and maintained significantly higher EF and FS values. These findings indicate that Cracd deficiency effectively attenuates post-infarction LV dilation and preserves global systolic function.
Speckle-tracking strain analysis
Left ventricular myocardial motion and deformation were further evaluated by speckle&#8209;tracking echocardiography using only parasternal long&#8209;axis views (Figure 3A). To ensure data reliability, we defined pragmatic criteria for acceptable output based on the capabilities of the VevoStrain software. Acceptable strain analysis required: (i) a clear parasternal long&#8209;axis view with endocardial borders visible throughout the cardiac cycle; (ii) a stable heart rate between 450&#8211;550 bpm during acquisition; (iii) after automatic tracking, the colour&#8209;coded mesh (activated via &#8220;toggle contour/vector/orbit line/B mode&#8221;) had to closely follow the endocardial and epicardial borders without jerking or losing contact; and (iv) strain curves had to be smooth, show consistent waveforms across segments, and lack sudden spikes or arrhythmic interruptions. Suboptimal output&#8212;most commonly erratic strain curves or inability to visualise clear motion trajectories&#8212;led to manual adjustment of endocardial or epicardial contours and re&#8209;analysis. If quality remained poor after three attempts, the mouse was excluded. Using these criteria, we obtained reliable strain data in WT&#8209;MI mice and Cracd&#8209;deficient MI mice.
Compared with the sham group, WT-MI mice exhibited significantly reduced radial velocity (Figure 3B) and longitudinal velocity (Figure 3C), as well as radial displacement (Figure 3D) and longitudinal displacement (Figure 3E), indicating impaired global myocardial motion. The absolute values of radial strain (Figure 3F), radial strain rate (Figure 3G), longitudinal strain (Figure 3H), and longitudinal strain rate (Figure 3I) were also markedly decreased, reflecting severely compromised regional myocardial deformation and function. In contrast, Cracd-deficient mice showed significant improvement in these parameters. Compared with the WT-MI group, they displayed better recovery of radial and longitudinal displacements. Furthermore, radial velocity, radial strain, and radial strain rate were maintained at higher levels, while longitudinal strain and longitudinal strain rate were significantly improved. These results suggest that Cracd deficiency not only preserves global systolic function but also enhances regional LV myocardial deformation after MI.
The speckle&#8209;tracking imaging analysis also included visualization of segmental strain distribution and cardiac motion trajectories. Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images with segmented six regions (BA, MA, AA, AP, MP, BP) and color gradient mapping are displayed in Figure 4A. Cardiac motion trajectories, time&#8209;to&#8209;peak curves for radial and longitudinal strain, parametric distribution maps of strain synchrony, and three&#8209;dimensional reconstructions are presented in Figure 4B. These data further support the functional improvements observed in Cracd&#8209;deficient mice.
Histological examination
To assess the protective effect of Cracd deficiency against MI, histopathological examination was performed on heart sections from WT and Cracd-deficient mice at 7 days post-MI using H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Whole&#8209;heart longitudinal sections are shown in Figure 5A, with quantitative analysis of infarct size and collagen content presented in Figure 5B and Figure 5C, respectively. High&#8209;magnification views of the infarct zone, border zone, and remote zone are displayed in Figure 5D. In WT-MI hearts, H&#38;E staining showed pronounced left ventricular wall thinning and a well-demarcated infarct zone. Within the infarct region, extensive inflammatory cell infiltration, myocardial necrosis, and marked fibrosis with scar formation were observed. In the border zone, inflammatory infiltration, myocardial necrosis, fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy were evident, while the remote zone displayed prominent hypertrophic changes. Corresponding Masson&#39;s trichrome staining further demonstrated extensive interstitial fibrosis within both the infarct and border zones of WT hearts following MI. In contrast, Cracd-deficient mice exhibited substantially attenuated pathological alterations, including reduced wall thinning, diminished inflammatory infiltration and myocardial necrosis, less pronounced cardiomyocyte hypertrophy, and markedly decreased interstitial fibrosis compared with WT-MI hearts. These histological findings indicate that Cracd deficiency mitigates post-infarction myocardial damage and adverse remodeling.
Successful protocol execution should yield: (i) a well&#8209;demarcated infarct zone with extensive collagen deposition in WT-MI hearts; (ii) clear cellular morphology without staining artifacts; and (iii) significantly attenuated pathology in Cracd&#8209;deficient MI hearts. Although infarct size may vary with ligation precision, the genotype&#8209;dependent difference is a reliable indicator of successful performance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig1c1.jpg" /> 
Figure 1: Generation of Cracd-deficient mice. (A) Construction of Cracd-deficient mice. (B) Schematic of the Cracd gene modification strategy. (C) PCR genotyping of tail genomic DNA. WT mice show a single 357 bp band, while homozygous (Cracd&#8209;deficient) mice show a single 421 bp band. (D) Sanger sequencing of genomic DNA confirmed the predicted deletion in the Cracd locus of deficient mice compared to WT controls. (E) Western blot analysis showed significantly reduced CRACD protein levels in the hearts of Cracd-deficient mice compared to WT controls. n = 6 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was calculated with a two-tailed unpaired Student&#39;s t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig2c1.jpg" /> 
Figure 2: Echocardiographic assessment of cardiac function. (A) Representative B-mode and M-mode echocardiographic images of mouse hearts at diastole and systole. Quantitative analysis of (B) interventricular septum thickness at diastole (IVSd) and (C) systole (IVSs), (D) left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and (E) systole (LVIDs), (F) left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd) and (G) systole (LVPWs), (H) ejection fraction (EF), and (I) fractional shortening (FS). n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig2largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig3c1.jpg" /> 
Figure 3: Speckle-tracking strain analysis. (A) Representative images of left ventricular wall motion and deformation at diastole and systole. Quantitative analyses of the following parameters: (B) radial velocity, (C) longitudinal velocity, (D) radial displacement, (E) longitudinal displacement, (F) radial strain, (G) radial strain rate, (H) longitudinal strain, and (I) longitudinal strain rate. n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig4d1.jpg" /> 
Figure 4: Speckle-tracking imaging in WT-Sham, WT-MI, Cracd-deficient Sham, and Cracd-deficient MI groups at 7 days post-MI. (A) Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images. Left ventricular wall was segmented into six regions: BA (basal anterior), MA (mid anterior), AA (apical anterior), AP (apical posterior), MP (mid posterior), and BP (basal posterior). Color gradient from blue to red represents increasing strain magnitude. (B) Cardiac motion trajectories; time-to-peak curves for radial and longitudinal strain values along with corresponding peak times. Parametric distribution maps of strain synchrony (blue/red indicate direction: radial &#8211; away from/toward center; longitudinal &#8211; away from/toward apex). White dots = highest velocity regions, black dots = lowest velocity. Three-dimensional reconstructions (X: time, Y: spatial position, Z: strain magnitude). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig4larged1.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig5c1.jpg" /> 
Figure 5: Histopathological analysis of cardiac remodeling after MI. (A) Whole-heart longitudinal sections with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Scale bars: 2 mm. (B) Quantitative analysis of infarct size and (C) collagen content. (D) High&#8209;magnification views of infarct zone (IZ), border zone (BZ), and remote zone (RZ). H&#38;E: yellow circles = inflammatory infiltration; black arrows = myocardial necrosis; green stars = fibrosis; blue arrows = hypertrophy. Masson&#8217;s trichrome:&#160;blue indicates collagen deposition. Scale bar: 50 &#956;m. n = 5 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig5largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

심근경색 후 리모델링 연구를 위한 CRISPR/Cas9 공학 기반 Cracd 결핍 마우스 모델의 생성 및 표현형 특성 분석

심근경색(MI)은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인으로 남아 있습니다. 본 프로토콜에서는 ...을 생성하고 특성화하는 방법을 설명합니다.

We study how Cracd-deficiency influences heart remodeling and function after myocardial infarction using a Cracd-deficient mouse model. This protocol can be applied to study gene functions in post-MI cardiac remodeling by combining CRISPR knockout with vivos during imaging. To begin, use CRISPR-Cas9 gene editing technology to generate Cracd-deficient mice on a C57BL/6N background.Place the anesthetized mice in a supine position on a surgical platform and confirm deep anesthesia by the absence of the pedal withdrawal reflex. Then perform orotracheal intubation using a 20 gauge intravenous catheter sheath. Place a small tuft of cotton wool at the opening of the tube to confirm successful intubation as it moves rhythmically with the mouse's breathing.Connect the tube to a mechanical ventilator upon successful intubation to maintain ventilation and anesthesia with 2%isoflurane. Apply ophthalmic ointment to both eyes to prevent corneal drying. Then remove the hair from the anterior chest using a depilatory cream and disinfect the surgical area by applying povidone iodine and 70%alcohol multiple times.After fully exposing the skin, make a 1 to 1.5 centimeter incision in the left chest wa

generation-phenotypic-characterization-crisprcas9-engineered-cracd

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 재현성을 높이기 위해 좌전 하행 동맥 (LAD)에 결찰의 위치에서 더 명확 수 있습니다 마우스 모델에서 심근 경색 (MI)을 시뮬레이션하기 위해 실험 허혈 / 재관류 (I / R) 손상을 유발하는 수술 방법을 소개합니다 마우스에있는 MI 실험.

왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

심부전은 입원의 주요 원인이자 사망의 주요 원인입니다. 마우스에서 좌측 전방 하행 관상동맥의 영구 결찰 모델을 적용하여 심근경색 후 심실 리모델링 및 심장 기능 장애를 조사합니다. 마우스의 침습적 혈류역학적 측정 기술이 제시됩니다.

마우스의 왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰 : 심근 경색 리모델링과 심장 마비의 모델

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

여기서 우리는 마우스에서 좌측 전방 의 관상 동맥의 영구적 인 결찰을 달성하는 방법을 보여주는 외과 적 절차를 설명합니다. 이 모형은 심근 경색의 병리생리학 및 수반되는 생물학 프로세스를 조사하기 위하여 높은 관련성입니다.

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

이 문서는 마우스에서 심근 극저온 손상 후 심장 리모델링을 연구하는 모델을 보여줍니다.

마우스에서 심근 경색을 연구하는 극저온 손상 모델

이 프로토콜은 마우스에서 심근 경색 후 modRNA를 사용하여 관심 유전자를 일시적으로 조절하는 간단하고 일관된 방법을 제시합니다.

심근 경색 마우스 모델에서 수정된 mRNA의 납품

우리는 여기에 설명, Tg의 설립 및 응용 프로그램 (Myh6-cre)1Jmk / J /Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)(CAG-GCaMP3)(αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 아래라고함) 심장 재프로그래밍 평가를 위한 마우스 리포터 라인. 마우스 균주로부터 분리된 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 유도된 심근세포(iCM)로 변환되어 칼슘(Ca2+) 플럭스를 통해 iCM의 재프로그래밍 효율과 기능성 성숙을 편리하고 효율적으로 평가할 수 있습니다.

GCaMP3 리포터와 심장 특정 칼슘 플럭스를 측정하여 심장 재프로그래밍의 체외 평가

우심실과 좌심실 사이에는 몇 가지 차이점이 있습니다. 그러나 우심실 경색 (RVI)의 병리 생리학은 명확하지 않습니다. 본 프로토콜에서, RVI 마우스 모델 생성을 위한 재현가능한 방법이 도입되고, 이는 RVI의 메카니즘을 설명하기 위한 수단을 제공할 수 있다.

마우스에서 우측 관상동맥의 영구적 결찰에 의해 유도되는 우심실 심근경색의 생성 및 특성화

이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 제브라피쉬 배아에서 정밀한 녹인 편집을 용이하게 하는 접근 방식을 설명합니다. 표현형 파이프라인은 Long QT 증후군 관련 유전자 변이체를 모델링하기 위한 이러한 기술의 적용 가능성을 입증하기 위해 제시됩니다.

CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

Photothrombosis 매우 재현성 방식으로 관심 분야의 작은 잘 구분 경색을 유도하기위한 빠르고, 최소 침습 기술입니다. 그것은 형질 전환 생쥐에서 뇌의 가소성을 기본 세포 및 분자 반응 연구를 위해 특히 적당하다.

Photothrombotic 국소 빈혈 : 마우스 스트로크 연구를위한 최소 침습 및 재현성 광화학 대뇌 피질의 병변 모델

Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (Guangdong Provincial Laboratory Animals Monitoring Center).  This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

심근경색 후 리모델링 연구를 위한 CRISPR/Cas9 공학 기반 Cracd 결핍 마우스 모델의 생성 및 표현형 특성 분석

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