Name: MEFs부터를 Matrigel하기 : MEFs의 면전에서 Passaging hESCs를 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-04T23:27:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 학습하세요 MEF 피더 세포와 Matrigel을 사용한 hESC 배양 및 다능성 유지 방법. 이 절차는 재생의학 연구에서 줄기세포 배양의 핵심 기술을 단계별로 보여줍니다.

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Teitell 연구실에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 UCLA, 특히 박사 Amander 클라크 박사 제롬 잭, 우리의 연구들의 지원 UCLA 브로드 연구소 줄기 세포 핵심 시설의 멤버에 재생 의료 및 줄기 세포 연구의 브로드 센터의 회원을 감사드립니다.

분리 인간의 배아 줄기 세포 (hESCs)는 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)에 도금 일반적으로 합류 hESC 접시는 특정 hESC 라인에 따라 1시 10분에서 1시 6분까지을 분할 수 있습니다. 분할 플레이트는 분리 후 다시 5-7일 합류하게 될 것입니다. <ol><li> 분할 이틀 전에는 0.1 % 젤라틴 용액을 사용하여 번호판을 아교 질로 만들다. 6 - 잘 접시, 야간 37 ° C 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터의 각 잘하고 품어 플레이트에 2ml를 추가합니다. </li><li> 플레이트 MEFs는 gelatinized 6 잘 접시에 하루는 분할에 hESCs를 계획하기 전에. (참고 : MEFs 3 일 전에 필요한 경우 많은처럼 도금 수 있습니다 ~ 3 일 후, MEFs은 아첨 확산 아웃 더 MEFs 수 hESCs뿐만 아니라 최신을​​ 유지 수 없습니다된다..) G - 반구 또는 mitomycin의 약병을 가지고 C는 37 ° C의 물 목욕 2 분 액체 질소와 해동에서, 5-6 X 10 6 세포를 포함, CF1 MEFs 치료. 50ml 팰컨 튜브에 따뜻한 MEF 문화 미디어로 한 번 세포를 씻고 따뜻한 MEF 문화 미디어의 마지막 볼륨 resuspend. 5-6 X 10 6 세포에서이 정도면 충분 접시 두 개 또는 세 6 - 잘 접시입니다. </li><li> MEFs 세차되고 있지만, gelatinized 접시를 꺼내 우물에서 모든 솔루션을 제거하고 잘 따라 MEF 문화 미디어 2.5 ML를 추가합니다. </li><li> 각 우물에 최종 볼륨으로 3ml 달성하기 위해 잘 당 MEF 서스펜션의 0.5 ML를 추가합니다. MEFs가 고르게 정착 하룻밤 인큐베이터에 다시 분산과 장소 플레이트 있는지 확인합니다. </li><li> hESC 분리의 날, 1mg/ml의 &lt;이주 된 무균 collagenase IV 솔루션을 새로운 준비하거나 사용합니다. 당신은 분할하려는 hESC의 우물에서 모든 미디어를 제거 2ml 당 잘 따뜻한 1 × PBS, pH를 7.4로 한번 씻어 및 collagenase IV 솔루션 1ml 추가할 수 있습니다. 37 ° C 50-10 분 알을 품다. 인큐베이터 밖으로 6 잘 hESC 판을 가지고 각 잘하는 ES 미디어 (bFGF없이)의 1ml를 추가합니다. 1ml 피펫으로 각 우물에 솔루션을 사용하면 미디어를 빨아하고 접시의 줄기 세포를 날려. 각 물론이 약 5-10 반복하게됩니다. 그런 다음, 50ml 팔콘 튜브에 정지 hESCs를 전송합니다. 분할되는 모든 우물에 대해이 작업을 수행 하나 50ml 팔콘 튜브에 결합. 펠렛은 5 분 200g에 실온에서 hESCs와 bFGF를 부족한 ES 매체와 한 번 씻으십시오. </li><li> hESCs 세차되고 있지만, MEF의 접시를 꺼내 우물에서 모든 미디어를 제거하고 함께 한번 씻어 살균, 따뜻한 1 × PBS, 산도 7.4 다음 ES 미디어 2.5 ML (지금은 10 NG / ML bFGF와 보충) 당을 추가 음. </li><li> 10ng/ml bFGF와 함께 보충 ES 미디어의 적절한 볼륨에 pelleted hESCs을 Resuspend. (참고 :.. hESCs가 resuspended 때, 그들은 대략 균일한 콜로니 크기와 모양이어야합니다 resuspension 볼륨 분할 비율에 따라 달라집니다) 조심스럽게 피펫은 hESC 중지 위아래로 몇 번 식민지가 더 작고 균일하게하기 위해, 하지만 정말 하나의 셀 또는 아주 작은 식민지가 생성됩니다. 각 우물에 최종 볼륨으로 3 ML을 달성하기 위해 MEF 플레이트에 잘 당 hESC 서스펜션의 0.5 ML를 추가합니다. 시각 hESCs가 밤새 해결하기 위해 인큐베이터에 다시 접시를 삽입하기 전에 균일하게 분산되어 있는지 확인합니다. 도금 후, 일반적으로 그들의 특성 모양과 테두리 모양을 맡을 식민지에 대한 몇 일 소요됩니다. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science . 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology+%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다. 도금 전에 마지막 단계에서 hESCs가 resuspended 때, 그들은 약 균일 콜로니 크기와 모양을해야합니다. 조심스럽게 hESC의 정지를 피펫 아래 몇 번 식민지가 더 작고 균일하게하기 위해,하지만 너무 많은 단일 셀 또는 아주 작은 식민지 같은 월 hESC pluripotency 마커에 대한 generated.Immunofluorescence 염색법과 현미경이나 흐름 cytometry있다 4 SSEA - 4, 문화 중에 undifferentiated 상태에서 hESCs의 유지를 확인하기 위해 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>시약</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>시약</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>시약</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>시약</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 항체</td><td>시약</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;rythrin 접합 Mouse IgG3</td><td>시약</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITCI 접합 항토끼 IgG</td><td>시약</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

mefs부터를 matrigel하기 : mefs의 면전에서 passaging hescs를

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다.

이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다. 3 부 1.

MEFs부터를 Matrigel하기 : MEFs의 면전에서 Passaging hESCs를

이 영상에서는 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 피더 세포상에서 인간 배아 줄기세포(hESCs)를 배양하는 방법을 설명합니다.

재생 의학 분야에서의 상당한 잠재력으로 인해, 인간 배아줄기세포의 생물학적 특성과 조작에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 이 영상에서는 마우스 배아 섬유아세포 피더 세포를 이용하는 방법과 Matrigel을 이용한 피더 프리(feeder-free) 조건에서 인간 배아줄기세포를 다능성 상태로 배양하고 유지하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 병리학 및 실험의학과의 Jinjiang입니다.오늘은 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast) 기반의 피더 세포(feeder cells) 및 Matrigel을 이용한 피더 프리(feeder-free) 조건에서 인간 배아줄기세포를 배양하는 절차를 보여드리겠습니다. 본 절차에는 마우스 배아 섬유아세포 준비, Matrigel 상에서 성장을 위한 조건 배지 제조, 그리고 시간이 경과함에 따라 인간 배아줄기세포를 공급 및 성장시키기 위한 Matrigel 플레이트와 매스의 준비 과정이 포함됩니다. 그럼 시작하겠습니다.배양 절차를 시작하기 위해, 인간 배아 유사 줄기세포를 마우스 배아 섬유아세포 또는 ME S 위에 플레이팅합니다. ME S에 플레이팅된 인간 배아 줄기세포를 분할합니다. 우리는 합류된(confluent) 인간 배아 줄기세포에서 시작하여, 특정 배아 줄기세포 라인에 따라 1:6에서 1:10의 희석 배율로 플레이팅합니다. 세포를 실제로 분할하기 전, 분할 후 5~7일이 지나면 다시 합류 상태가 됩니다. Checon사의 0.1% 젤라틴 용액을 사용하여 2일 전에 젤라틴 코팅 플레이트를 준비했습니다.6-웰 플레이트를 사용하는 경우, 각 웰에 2 mL를 넣고 37 °C, 5% CO2 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 젤라틴화된 6-웰 플레이트에 MACs를 플레이팅합니다. 필요한 경우 MACs는 최대 3일 전에 플레이팅할 수 있습니다.하지만 3일 이상 된 세포의 사용은 권장하지 않습니다. 5~6 × 10⁶개의 세포를 포함하는 방사선 조사 또는 mitomycin C 처리된 CF OneFS 스톡 바이알을 액체 질소에서 꺼내 37 °C 항온수조에서 2분 동안 해동하십시오. 세포가 해동되면 15 mL Falcon 튜브에서 따뜻한 meth media로 총 5~6 × 10⁶개의 세포를 한 번 세척하십시오.각 웰에 3 mL의 배지가 들어 있는 6웰 플레이트 두 개 또는 세 개가 보입니다.

from-mefs-to-matrigel-i-passaging-hescs-in-the-presence-of-mefs

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생물학

이 비디오에서 우리는 우리의 실험실은 정기적으로 트립신과 색채 인간 배아 줄기 세포 라인을 통로 방법을 보여줍니다.

트립신과 Passaging 색채 인간의 배아 줄기 세포 - 라인

이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 2.

Matrigel에 MEFs에서 분리 hESCs : MEFs에서 Matrigel 2

이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 3.

MEFs에서 Matrigel 3 : Matrigel에 Matrigel에서 Passaging hESCs

특정 세포로 hESCs의 감독 차별은 재생 의학에 많은 관심을 생성했다. 우리는 결정을위한 간결하고 단계별 절차를...

기형 종의 형성에 의해 인간 배아 줄기 세포의 운명 매핑

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

전환 문화에 피더 - 무료 조건에 지속적인 노력에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 유도와 문화 마우스 배아 피더 (MEFs)와 공동 문화에 달려 남아 있습니다. 여기, 우리는 신속하게 이전 실험에 hESC 문화에서 피더를 제거 소설 방법을 보여줍니다.

고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

여기에서는 해리된 단일 세포의 비집락형 단층(NCM) 성장을 기반으로 하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배양 프로토콜을 제시합니다. Rho 관련 키나아제 억제제 또는 라미닌 동형(laminin isoform 521, LN-521)을 활용하는 이 새로운 방법은 다량의 동질적인 hPSC 생산, 유전자 조작 및 약물 발견에 적합합니다.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

리포터 세포주 시각화 추적 이종 집단의 관심의 세포를 분리 할 수​​있는 수단을 제공한다. 그러나, 유전자 - 표적 인간 배아 줄기 세포에서 종래의 상동 재조합을 사용하여 매우 비효율적이다. 여기서, 우리는 아연 핑거 클레아 향상된 상동 재조합을 사용하여 EGFP CNS 중뇌 특정 전사 인자 PITX3 궤적 타겟팅 기술한다.

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

학습하세요 MEF 피더 세포와 Matrigel을 사용한 hESC 배양 및 다능성 유지 방법. 이 절차는 재생의학 연구에서 줄기세포 배양의 핵심 기술을 단계별로 보여줍니다.

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