Name: 인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 탐색하세요 인간 배아 줄기 세포에서 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체의 활성을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기법은 줄기 세포 생물학에서 미토콘드리아 기능을 이해하는 데 필수적입니다.

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Teitell 연구소에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 현재 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 이러한 추가적인 연구에 조언과 통찰력을 제공하는 박사 칼라 쾰러 (UCLA)와 쾰러 실험실 구성원 감사합니다.

Mitochondrial 콤플렉스에 대한 고해상도 네이티브 클리어 젤 Electophoresis (hrCNE)가 인 - 젤 활동 Assays 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)은 다음 표준 약관을 사용 MEF - 냉방 중간에 5 일 동안 Matrigel에서 성장으로 전환 ˠ - 조사 또는 mitomycin C - 대우 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)의 monolayer에서 유지 관리되었습니다. MEFs 오염을 제거하려면, hESCs는 Matrigel에 다시 도금 및 추가 3 일간 MEF - 냉방 매체 성장했다. pluripotency 마커 월 4 SSEA - 4 Immunofluorescence 현미경은 hESC 차별 부족을 확인하는 데 사용되었다. <ol><li> 5 분 trypsinization (6 잘 플레이트에 따라 잘 1ml 1X의 트립신) 다음 따뜻한 1X PBS, pH를 7.4와 세포를 씻으십시오. </li><li> 신선한 트립신 억제제의 동일한 음량을 (1X PBS, pH를 7.4에서 1mg/ml) 추가합니다. 200g에 수확 세포와 원심 분리기, 5 분, 실온. </li><li> 신선한 1 &#39;테아제 억제제 칵테일과 함께, 1.7ml (세포 펠렛의 크기에 따라) 얼음 차가운 mitochondria 절연 버퍼 (6.6mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0 83mM 자당)의 - 0.8에서 뜨는 및 resuspend pelleted 세포를 폐기하십시오. 10 분 얼음에 품어. </li><li> 균 질기 (- 50 치기 ~ 40)와 세포를 다운스. 가벼운 현미경을 사용하여 균질의 완전성을 확인 trypan 파랑과 dounced 세포의 나누어지는 스테인. </li><li> 4 10 분 2만그램에서 원심 분리기 ° C 또한 핵 및 큰 세포 조각이 들어있는 원유 mitochondrial 펠렛을 얻을 수 있습니다. 가만히 따르다가와 뜨는을 버리고 시켰던 원유 mitochondrial 펠렛의 무게. 펠렛은 -80에 저장할 수 있습니다 ·이가 멈추는 지점있다면 C 액화 질소에 즉시 냉동에 따라. 참고 : 차등 원심 분리 또는 기타 그라디언트 기반 절차가 순수한 mitochondrial 막 분획을 분리하고 수집하기 위해 사용될 수 있습니다. 심판을 참조하십시오. 자세한 내용은 4. 이러한 대체 방법은 mitochondrial 단백질 대신 세포 중량 또는 휴대폰 번호의 MG 당 복잡한 활동의​​ MG 당 mitochondrial 복잡한 활동을 얻을 것입니다. mitochondrial 단백질의 농도는이 비교를하기 위해 정화 후 결정이 필요합니다. 또한, 다른 절연 버퍼이 접근 방식이 필요할 수 있습니다. 순수 mitochondrial 막 분획의 solubilization 들어, 아래의 단계 6 다음의 참고를 참조하십시오. </li><li> 얼음 차가운 solubilization 버퍼 (50mM NaCl, 50mM 이미다졸 / HCL 산도 7.0, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2mM 6 aminohexanoic 산성)과 vortexing하여 얼음에 원유 mitochondrial 펠렛을 Solubilize. 6 - aminohexanoic 산성은 1X 테아제 억제제 칵테일로 교체할 수 있습니다. 펠렛 중량의 20mg 당 solubilization 버퍼의 35μl를 사용하십시오. 10% 펠렛 중량 및 튜브를 flicking하여 믹스 20mg 당 W / V digitonin의 20μl를 추가합니다. 얼음 5-10 분 알을 품다. Dodecyl - BD - maltoside 또는 트리톤 X - 100은 단백질을 solubilize하는 digitonin에 대한 대체하실 수 있습니다. 세제 및 수량의 선택은 supercomplexes 또는 mitochondrial 단지의 multimeric 형태의 형성에 영향을 줄 수 있습니다. 자세한 내용은 ref.1를 참조하십시오. 참고 : 순수한 mitochondrial 막 분획을 solubilize에 필요한 세제의 수량 2~6그램 / G. 이르는 세제 / 단백질 무게 비율에 해당하는 mitochondrial 세포막을 solubilize하는 최적의 비율이 dodecyl - BD - maltoside에 대한 G / 2.5G이며, 대한 3g / G 트리톤 X - 100과 6g / digitonin에 대한 g. </li><li> 4 15 분 ° C.에 대한 10만그램에서 solubilized 펠릿을 원심 분리기 맑은 뜨는를 수집합니다. </li><li> 최종 5% W / V 글리세롤과 0.01 % W / V 개양귀비빛의 S (50 % W / V 글리세롤, 0.1 % W / V 개양귀비빛의 S 로딩 버퍼 재고 솔루션을 사용)에 버퍼를 로드할 추가합니다. </li><li> 레인 당 원유 mitochondrial 펠릿 20 - 40mg이 들어있는 볼륨 젤 우물을로드합니다. 3.5 %가 젤 스태킹있는 아크릴 아미드 기울기 젤 (4 -13 %)를 사용합니다. 참고 : 젤 준비와 전기 영동 조건 : bisacrylamide의 아크릴 아미드와 1.5g (49.5 % T, T는 AA와 bisAA와 C의 총 농도는 3% C.가의 48g : 겔 준비, 다음과 같은 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 (AA / bisAA) 3 믹스를 사용하여 총 단량체로 crosslinker (bisAA)의 비율). 젤 버퍼 (3 &#39;) : 1.5M 6 - aminohexanoic 산성, 75mM 이미다졸, 산도 7.0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> 그라데이션 젤 : </td><td> 4퍼센트 </td><td> 13% </td><td> 젤 스태킹 : </td><td> 3.5 % </td></tr><tr><td> AA / bisAA 세 믹스 </td><td> 2 ML </td><td> 6.5 ML </td><td></td><td> 0.6 ML </td></tr><tr><td> 젤 버퍼 3 &#39; </td><td> 8.3 ML </td><td> 8.3 ML </td><td></td><td> 2.7 ML </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td></td><td> 5g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14.7 ML </td><td> 5 ML </td><td></td><td> 4.7 ML </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> 25 ML </td><td> 25 ML </td><td></td><td> 8 ML </td></tr><tr><td> 10 % APS </td><td> 139 μl </td><td> 125 μl </td><td></td><td> 67 μl </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 μl </td><td> 12.5 μl </td><td></td><td> 6.7 μl </td></tr></tbody></table> 양극 버퍼 : 25mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0 음극 버퍼 : 50mM Tricine, 7.5mM 이미다졸 / HCL, 0.02 % W / V dodecyl - BD - maltoside, 0.05 % W / V deoxycholate, 산도 7.0 기름을 붓고 감기 방 (4-7 ° C)에서 젤을 실행합니다. 사용되는 초기 전압은 100V입니다. 예제는 스태킹 젤 입력되면, 전압은 15mA (0.15 &#39;14&#39;14 cm 젤)로 현재 제한과 500V 증가합니다. 전기 영동은 붉은 개양귀비빛의 S 염료의 날카로운 라인이 젤 전면에 접근 3-4 H 후에 중지됩니다. 또는 젤은 70 100V에서 일정한 전압 밤새 실행할 수 있습니다. <ol><li> 인 겔 활동 assays. 각 분석에 대한 부화의 시간은 단백질 solubilization의 효율성과 잘 당 로드된 자료의 양에 따라 달라집니다. 단지 I, IV 및 V는 일반적으로 단지 II 및 III보다 강한 신호를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 콤플렉스 I (CI) 몇 시간 동안 실온에서 CI 버퍼 (2.5mg/ml NBT,, 0.1mg/ml NADH 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4)로 겔 슬라이스를 품어. CI 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 : 0.01g NADH 0.25g NBT 15-45 분의 50 %와 10 %의 메탄올 초산에​​서 젤 수정. 고정 젤은 10% 초산에 보존되어 있습니다. 콤플렉스 II (CII) 몇 시간 동안 실온에서 CII 버퍼 (5mM 트리스 - HCL pH는 7.4, 0.2mM phenazine의 methasulfate,, 2.5mg/ml NBT succinate 20mM 나트륨)로 겔 슬라이스를 품어. CII 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 : 200μl 1M 나트륨 succinate 80μl의 phenazine의 methasulfate (250mM PMS는 DMSO에 용해) 0.25g NBT 처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정 콤플렉스 III (CIII) 상온에서 몇 시간 동안, CIII 버퍼 (0.05 % 3,3 &#39;- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB) 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어. CIII 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 : 50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride 처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정 콤플렉스 IV (문학) 몇 시간 동안 실온에서, 문학 버퍼 (0.05 % 3,3 &#39;- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB), 50μM 말을 마음 시토크롬 C 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어. 문학 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 : 50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride 0.1g 말을 마음 시토크롬 C 처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정 콤플렉스 V (CV) CV 버퍼 (35 밀리 트리스베이스, 270mM 글리신, 25 pH를 8.3 ° C, 14mM MgSO 4, 0.2 % W / V PB (NO 3) 2, 필름 ATP) 몇 시간 동안 실온에서.로 겔 슬라이스를 품어 CV 버​​퍼 : 솔루션의 당 100ml 추가 : <table border="0"><tbody><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> PB (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> 산도를 (8.3 있어야합니다) 조정 필요 - 산성이나베이스를 사용하지 마십시오. 필터 추가 <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> 30 분 50 % 메탄올에서 젤를 수정하고 물을 전송할 수 있습니다.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포, 높은 해상도 명확한 기본 겔 전기 영동 (hrCNE)하여 분리하고, 인 겔 촉매 활동 assays에 의해 이후의 분석에서 mitochondrial 단백질 단지의 추출을 설명합니다. hrCNE 파란색 기본 겔 전기 영동의 비교 해상도 mitochondrial 막 단백질 단지를 해결 및 - 겔 활동 assays를위한 우수합니다. 이 기술은 mitochondrial 호흡 단지 IV를 정할뿐만 아니라 hESCs과 그들의 유도체 자손 모두에 어떤 mitochondrial 막 단백질 복합의 subunit 구성을 분석할뿐만 아니라 고용 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>NaOH로 pH를 8.0으로 조정</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1M Sodium succinate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 및 BP329-1</td><td>1M Na2HPO4 68.4 ml와 1M NaH2PO4 31.6 ml를 혼합하여 25 C에서 pH 7.2의 0.1M sodium phosphate buffer를 제조</td></tr><tr><td>1M Tricine, pH 7.0 (NaOH로 조정)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>4 C에서 보관</td></tr><tr><td>1M imidazole/HCl, pH 7.0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>4 C에서 보관</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>물에 용해. 1 ml씩 분주하여 &amp;#8211;20 C에서 보관.</td></tr><tr><td>10% (wt/vol) digitonin (&amp;gt;50% 순도, 재결정 없이 사용)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>물에 용해. 0.1&amp;#8211;1 ml씩 분주하여 &amp;#8211;20 C에서 보관. 사용 전 95 C로 가온해야 함.</td></tr><tr><td>2M 6-aminohexanoic acid</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>4 C에서 보관</td></tr><tr><td>10x Ponceau S/glycerol 스탁 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 및 G6279-1L</td><td>물에 0.1% Ponceau S, 50% glycerol (wt/vol) 포함.</td></tr><tr><td>10% w/v sodium deoxycholate</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>물에 용해. 빛으로부터 보호해야 함. HCl로 pH를 7.0으로 조정하고 여과 후 실온에서 보관.</td></tr><tr><td>250 mM phenazine methasulfate (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>DMSO에 용해 후 분주. &amp;#8211;20 C에서 보관.</td></tr><tr><td>Nitro-blue tetrazolium (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate disodium salt (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Grade I, 최소 99%</td></tr><tr><td>beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) 환원형</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>말 심장 유래 Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>&amp;#8211; 20 C에서 보관.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 염색액 0.4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x Trypsin (0.5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Inhibitor</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 배아 줄기 세포에서 mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria 세포질 세포의 대사 및 항상성에 주요 역할을 organelles, 세포 신호 네트워크의 규제 및 프로그램 세포 사망 있습니다. Mitochondria 생산 ATP는 세포질 산화 환원 상태와 Ca2 + 균형을 조절 지방산을 catabolize, 헴, 세포핵, 스테로이드 호르몬, 아미노산을 합성하고, 단백질의 철 - 유황 클러스터를 조립 도움이됩니다. Mitochondria는 열 생산에 필수적인 역할을했습니다. mitochondrial 게놈의 변이는 인간의 장애 여러 종류의 원인이됩니다. mtDNA 변이의 축적이 노화와 상호 및 암의 개발에 중요한 역할을 가지고 의심됩니다. 모든 세포 유형에서 극히 중요한 역할로 인해, mitochondria의 기능은 또한 줄기 세포에 중요합니다. 주요 진보는 줄기 세포 생존, 증식 및 분화 능력에 대한 우리의 이해에되었습니다. 그러나 줄기 세포의 기능 활동은, 특히 그들의 에너지 상태, 아직 자세히 연구되지 ​​않았습니다. 거의 아무것도 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 그들의 차별화된 전구체 자손의 mitochondrial 속성에 대한 알려진되지 않습니다. hESC 기능과 발달 가능성에 mitochondria의 역할을 이해하고 평가하는 한 가지 방법은 직접 mitochondrial 호흡 단지의 활동을 측정하는 것입니다. 여기, 우리는 hESCs의 다섯 호흡기 체인 단지를 분석하는 방법으로 젤 활동 시각화의 고해상도 명확한 기본 겔 전기 영동과 이후에 대해 설명합니다.

이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

미토콘드리아는 세포 대사와 항상성 유지, 세포 신호 전달 네트워크 조절 및 ... 등에 주요한 역할을 하는 세포질 소기관입니다.

미토콘드리아는 대사와 에너지 생산부터 세포 사멸 프로그램, 스테로이드 호르몬 합성에 이르기까지 세포 생리에서 수많은 역할을 수행합니다. 기본적인 세포 기능과 질병 모두에서 미토콘드리아가 갖는 중요성에도 불구하고, 인간 배아줄기세포 및 그 분화 후손 세포 내 미토콘드리아의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 본 영상에서는 인겔(Ingel) 활성 분석법을 사용하여 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아 호흡쇄 복합체를 분석하는 방법을 보여드리겠습니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 병리학 및 실험의학과의 Michael Tetel 교수 연구실 소속 Ivan OV입니다. 오늘은 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아 호흡 복합체 기능을 평가하는 절차를 보여드리겠습니다. 이 젤 내 활성 측정 절차에는 인간 배아줄기세포로부터 조 미토콘드리아 팰릿을 분리하는 과정, 고해상도 clear native polyacrylamide 젤 전기영동을 통해 산화적 인산화 시스템의 미토콘드리아 복합체를 분리하는 과정, 그리고 이어지는 젤 내 활성 측정 단계가 포함됩니다.이제 시작하겠습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 인간 배아줄기세포에서 미토콘드리아를 분리하는 것입니다. 본 분석에서는 피더 프리(feeder-free) 조건에서 마트리젤(matrigel)이 코팅된 플레이트에서 배양한 인간 배아줄기세포를 사용하겠습니다.인간 amry 줄기세포에서 미토콘드리아를 수집하기 위해, 먼저 따뜻한 1X PBS pH 7.4로 세포를 세척한 다음 5분 동안 트립신 처리(trypsinization)를 수행합니다. 6웰 플레이트의 웰당 1 mL의 1X trypsin을 사용할 수 있습니다. 5분 후, 1 mg/mL의 트립신 억제제가 포함된 1X PBS를 동일한 부피로 첨가하여 반응을 중단시키고 세포를 수확합니다.수집한 세포를 상온에서 200 ×g로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 1 × protease inhibitor가 포함된 갓 제조한 칵테일이 들어있는 0.8 ~ 1.7 mL의 ice cold mitochondria isolation buffer에 펠릿화된 세포를 다시 현탁합니다. 사용하는 버퍼의 양은 얻어진 세포 펠릿의 크기에 따라 달라집니다. 펠릿을 재현탁한 후, 얼음 위에서 약 10분간 배양합니다.배양 후 호모게나이저(homogenizer)를 사용하여 세포를 파쇄하며, 이때 약 40~50회 정도 반복합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

파킨슨 병을 일으키는 유전자에 변이를 가지고 환자의 섬유 아세포가 쉽게 접근 할 수를...

파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

여기에서는 (세포주기) 키나아제의 미토콘드리아 국소화를 연구하는 방법과 미토콘드리아 아래 위치 및 잠재적인 미토콘드리아 기질/표적을 결정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 단백질을 미토콘드리아로 강제 발현하는 것은 관심 단백질의 미토콘드리아 국소화의 기능적 결과를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

이전에 냉동 보관 된 고체 조직에서 미토콘드리아 농축 샘플의 준비는 다양한 실험 양식에서 미토콘드리아의 기능적 및 분석 평가를 모두 수행 할 수 있었습니다. 이 연구는 냉동 심장 조직에서 미토콘드리아농축 제제를 준비하고 미토콘드리아의 분석 평가를 수행하는 방법을 보여줍니다.

소우의 자손에서 이전에 냉동 된 심장 조직에서 미토콘드리아 전자 전송 복합체 측정 : 운동 유발 미토콘드리아 생물 에너지 변화를 평가하는 모델

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

인간의 배아 줄기 (ES) 세포의 전파

탐색하세요 인간 배아 줄기 세포에서 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체의 활성을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기법은 줄기 세포 생물학에서 미토콘드리아 기능을 이해하는 데 필수적입니다.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

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