인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

미토콘드리아는 신진대사 및 에너지 생산에서 세포 사멸 프로그래밍, 스테로이드 호르몬 합성에 이르기까지 세포 생리학에서 수많은 역할을 합니다. 미토콘드리아가 근본적인 세포 기능과 질병 모두에서 중요함에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포와 그 분화된 자손에서 미토콘드리아의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이 비디오에서는 Ingel 활성 분석을 사용하여 인간 amry 줄기 세포의 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체를 분석하는 방법을 보여줍니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스 캠퍼스 병리학 및 실험실 의학과의 마이클 테텔 실험실의 이반 OV입니다. 오늘은 인간 배아 줄기 세포에서 미토콘드리아 호흡 복합 기능을 평가하는 절차를 보여 드리겠습니다. 이러한 겔 활성은 인간 배아 줄기 세포에서 조잡한 미토콘드리아 구개를 분리하고, 더 높은 해상도의 투명 천연 폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동을 통한 삼출 인산화 시스템의 미토콘드리아 복합체를 분리하고, 이후 겔 활성 sa를 포함하는 이 절차를 평가합니다.

시작하겠습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 인간 배아 줄기 세포에서 미토콘드리아를 분리하는 것입니다. 이 분석을 위해 우리는 피더가 없는 상태로 마트리겔로 덮인 플레이트에서 자란 인간 배아 줄기 세포를 사용할 것입니다.

인간 암리 줄기 세포에서 미토콘드리아를 수집하기 위해 먼저 따뜻한 XPDS pH 7.4로 미토콘드리아를 세척한 다음 5분 동안 세포를 트립신합니다. 6개의 웰 플레이트에서 웰당 1mil의 1 x 트립신을 사용할 수 있습니다. 5분 후, 1 XPBS에 1 mil당 1 밀리그램의 새로운 트립신 억제제를 동일한 부피로 첨가하여 반응을 중지하고 세포를 수확할 수 있습니다.

그런 다음 수집된 세포를 실온에서 5분 동안 200배 G로 원심분리합니다. 방사 후, 상등액을 버리고 소생하고, 펠릿화 된 세포를 0.8-1.7 밀리리터의 얼음처럼 차가운 미토콘드리아 분리 완충액에 1 x 프로테아제 억제제의 갓 준비된 칵테일로 현탁시킵니다. 사용하는 완충액의 양은 얻는 세포 펠릿의 크기에 따라 다릅니다.펠릿이 재현탁된 후 얼음에서 약 10분 동안 배양합니다.

균질화기로 세포를 배양한 후 약 40-50번의 스트로크가 필요할 수 있습니다. DOD 세포의 분취량을 trian blue로 염색하고 광학 현미경을 통해 관찰하여 균질화의 전체 목록을 확인할 수 있습니다. 다음과 같이 표시되어야 합니다.

이것은 다운으로 50 스트로크 후 첫 번째 샷입니다. 이것은 다운으로 80 스트로크 후 두 번째 샷입니다. 일단 세포가 균질화되면, 20, 000 시간 G에 4 도 C.This에 10 분 동안 저희를 줄 것이다 조잡한 미토콘드리아 펠릿을 주면 또한 핵과 더 큰 세포 파편을 포함할 것이다.

펠릿을 수집하기 전에 후속 펠릿 중량을 추정하기 위해 수집 튜브의 무게를 측정하고 상층액을 붓고 버린 다음 침전된 미토콘드리아 미토콘드리아 펠릿의 무게를 측정해야 합니다. 이 시점에서 튜브의 무게를 빼면 펠릿을 용해시킬 수 있으며, 이는 다음 단계에서 보여줍니다. 미토콘드리아 펠릿을 용해시키기 위해 펠릿을 얼음 위에 놓고 35마이크로리터의 얼음 저온 가용화 완충액으로 볼텍싱하는 것으로 시작합니다.

우리가 가지고 있는 펠릿 20밀리그램당 완충액 화합물에 대한 자세한 정보는 함께 제공되는 서면 프로토콜에 언급되어 있습니다. 소용화 완충액의 와류 그리고 추가 다음 그리고 숫자 toin를 추가하기 전에, 우리는 고속 원심분리를 위해 적합한 관으로 resuspended 펠릿을 옮기고, 그 후에 펠릿 무게의 20 밀리그램을 위한 양 손가락 toin 당 10%weight의 20 마이크로리터를 추가하고 얼음에 5 10 분 동안 미토콘드리아 펠릿을 완전히 배양한 후에 관을 튕겨서 섞습니다. Doil beta D multiside 또는 DDM 또는 Triton X 100은 가용화된 단백질에 디지트 토인을 대체할 수 있습니다.

세제의 선택과 그 양은 얼음 위에서 배양 후 상부 복합체 또는 다중체 형태의 미토콘드리아 복합체의 형성에 영향을 미칠 수 있습니다. 그리고 펠릿이 용해되면 섭씨 4도에서 15분 동안 10만 배 G로 원심분리한 다음 투명한 상등액을 수집합니다. 이제 미토콘드리아의 천연 그래디언트 겔 전기영동을 위해 그래디언트 겔에서 작동하기 위해 상층액을 준비할 준비가 되었습니다.

3.5% 스태킹 젤과 함께 5%에서 13%까지의 아크릴아미드 구배 겔을 사용하는 것이 좋습니다. 겔을 준비하기 위해 서면 프로토콜에 설명된 대로 아크릴아미드 비스 아크릴아미드 혼합물을 사용합니다. 아크릴아미드 bis 아크릴아미드 용액은 미리 준비하여 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 보관합니다.

아크릴아마이드와 비스 아크릴아마이드는 분말 및 액체 형태의 독성 화학 물질이므로 작업할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 당사는 아크릴아미드 비스 아크릴아미드 용액을 pH 7.0에서 1.5몰 6아미노 헥사 노산과 75밀리몰 올레로 구성된 3 x 겔 버퍼의 분취액과 결합합니다. 버퍼에 추가하는 아크릴아미드 bis 아크릴아미드 용액의 양은 그라디언트 겔을 만들기 위해 만드는 퍼센트 겔에 따라 달라집니다.

우리는 하나의 4% 믹스와 하나의 13% 믹스를 만들 것이고 스태킹 겔은 3.5% 믹스가 될 것입니다. 13% 믹스에 글리세롤을 추가하는 것을 잊지 마십시오. 세 가지 혼합물이 모두 준비되면 혼합물에 황산염 및 테미드당 적절한 양의 암모늄을 첨가하고 혼합물을 구배 이전 주조 챔버에 붓습니다.

챔버의 왼쪽 부분에는 5% 믹스가 들어 있습니다. 챔버의 오른쪽 부분에는 작은 자기 교반 막대에 13 % 혼합물이 들어 있습니다. 챔버의 오른쪽 부분을 열어 젤을 붓기 시작합니다.

그런 다음 즉시 챔버의 왼쪽 부분을 열고 5% 용액을 13% 용액과 혼합하여 그래디언트를 만듭니다. 우리는 중합 후에 젤을 위한 예리한 똑바른 국경을 형성하기 위하여 젤의 정상에 소량의 이소프로판올을 추가합니다. 약 1시간 후 그라디언트 겔의 중합이 완료되면 이소프로판올을 제거하고 3.5 스태킹 겔을 장치에 붓고 겔 빗을 삽입합니다.

우리는 약 섭씨 4도에서 7도의 차가운 방에서 젤을 조립하고 실행할 것입니다. 이 젤을 실행하기 위해 두 가지 다른 버퍼를 사용합니다. 양극 챔버에서는 pH 7.0의 25밀리몰 올산 염산을 포함하는 버퍼를 사용합니다.

음극 완충액은 50 밀리미터 tric, 7.5 millimolar ole 염산, 부피 당 0.02 % 중량, doil beta D multiside 또는 DDM 및 부피에 0.05 % 중량, deoxy coate pH 7.0을 포함합니다. 방금 부은 겔에서 상등액을 실행할 준비를 하기 위해 로딩 버퍼를 추가하여 부피 글리세롤에 대해 5%중량, 부피에 대해 0.01중량의 최종 농도를 산출합니다. Ponto S, 우리는 일반적으로 글리세롤과 판초 S를 함유 한 10 x 스톡 용액을 상층액에 직접 첨가합니다.

이제 젤 샘플을 젤에 로드할 준비가 되었습니다. 우리는 레인당 20-40mg의 미토콘드리아 단백질을 포함하는 부피로 젤 웰을 로드할 것입니다. 로딩 직후 젤은 100볼트에서 작동합니다.

샘플이 스태킹 겔에 들어가면 전류가 15밀리암페어로 제한되는 상태에서 전압을 500볼트까지 높일 수 있습니다. 우리는 보통 70-100볼트에서 밤새 겔을 작동시키지만, 빨간색 염료의 날카로운 선이 겔 전면에 접근하면 전기영동을 멈춥니다. 이제 겔이 실행되었으므로 겔에서 직접 다양한 단백질 복합체의 활성을 분석할 수 있습니다.

각 분석에 대한 배양 시간은 단백질 가용화의 효율성과 웰당 적재되는 물질의 양에 따라 달라집니다. 일반적으로 1, 4, 5복합체는 2, 3군데보다 더 강한 신호를 생성합니다. 이것이 2 단지와 3 단지의 염색 시간이 더 길어야 하는 이유입니다.

복잡한 활동을 테스트하려면 각 복합체에 대해 특정 버퍼를 사용해야 합니다. 서면 프로토콜에서 개별 버퍼의 성분을 찾을 수 있습니다. 이제 겔의 개별 레인을 잘라내어 Ingel 활성 분석을 개별적으로 수행합니다.

모든 복합체에 대해 복합체 5를 제외한 모든 복합체에 대해 실온에서 몇 시간 동안 각각의 완충액에 겔 슬라이스를 배양합니다. 배양 후 50% 메탄올과 10% 아세트산에 15-45분 동안 젤을 고정합니다. 고정 젤은 10% 아세트산으로 보존됩니다.

여기에서 복잡한 염색이 어떻게 나타나는지 볼 수 있습니다. 젤 조각에는 복잡한 띠에 해당하는 짙은 보라색 띠가 하나 있습니다. 투명 젤을 사용하면 미토콘드리아 복합 활동에서 밀도 측정을 수행하고 비교 분석을 수행할 수 있습니다.

치밀한 세포 분석 후, 우리는 일반적으로 장기 보관 및 또는 스캔을 위해 젤 조각을 건조시켜 고품질 이미지 복합체를 얻기 위해 2개의 염색은 1개의 복합체 3 및 4개의 복합체와 동일한 자주색을 띱니다. 둘 다 주황색 또는 노란색 염색 띠를 제공합니다. 다음은 복잡한 2, 3, 4 염색 활동의 예입니다.

우리는 방금 인간 배아 줄기 세포에서 추출하고 천연 겔 전기를 포함하여 더 높은 해상도로 분리된 미토콘드리아 삼출 복합체의 활성을 분석하는 방법을 보여드렸습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.