Name: 인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 탐색하세요 인간 배아 줄기 세포에서 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체의 활성을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기법은 줄기 세포 생물학에서 미토콘드리아 기능을 이해하는 데 필수적입니다.

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Teitell 연구소에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 현재 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 이러한 추가적인 연구에 조언과 통찰력을 제공하는 박사 칼라 쾰러 (UCLA)와 쾰러 실험실 구성원 감사합니다.

Mitochondrial 콤플렉스에 대한 고해상도 네이티브 클리어 젤 Electophoresis (hrCNE)가 인 - 젤 활동 Assays 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)은 다음 표준 약관을 사용 MEF - 냉방 중간에 5 일 동안 Matrigel에서 성장으로 전환 ˠ - 조사 또는 mitomycin C - 대우 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)의 monolayer에서 유지 관리되었습니다. MEFs 오염을 제거하려면, hESCs는 Matrigel에 다시 도금 및 추가 3 일간 MEF - 냉방 매체 성장했다. pluripotency 마커 월 4 SSEA - 4 Immunofluorescence 현미경은 hESC 차별 부족을 확인하는 데 사용되었다. <ol><li> 5 분 trypsinization (6 잘 플레이트에 따라 잘 1ml 1X의 트립신) 다음 따뜻한 1X PBS, pH를 7.4와 세포를 씻으십시오. </li><li> 신선한 트립신 억제제의 동일한 음량을 (1X PBS, pH를 7.4에서 1mg/ml) 추가합니다. 200g에 수확 세포와 원심 분리기, 5 분, 실온. </li><li> 신선한 1 &#39;테아제 억제제 칵테일과 함께, 1.7ml (세포 펠렛의 크기에 따라) 얼음 차가운 mitochondria 절연 버퍼 (6.6mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0 83mM 자당)의 - 0.8에서 뜨는 및 resuspend pelleted 세포를 폐기하십시오. 10 분 얼음에 품어. </li><li> 균 질기 (- 50 치기 ~ 40)와 세포를 다운스. 가벼운 현미경을 사용하여 균질의 완전성을 확인 trypan 파랑과 dounced 세포의 나누어지는 스테인. </li><li> 4 10 분 2만그램에서 원심 분리기 ° C 또한 핵 및 큰 세포 조각이 들어있는 원유 mitochondrial 펠렛을 얻을 수 있습니다. 가만히 따르다가와 뜨는을 버리고 시켰던 원유 mitochondrial 펠렛의 무게. 펠렛은 -80에 저장할 수 있습니다 ·이가 멈추는 지점있다면 C 액화 질소에 즉시 냉동에 따라. 참고 : 차등 원심 분리 또는 기타 그라디언트 기반 절차가 순수한 mitochondrial 막 분획을 분리하고 수집하기 위해 사용될 수 있습니다. 심판을 참조하십시오. 자세한 내용은 4. 이러한 대체 방법은 mitochondrial 단백질 대신 세포 중량 또는 휴대폰 번호의 MG 당 복잡한 활동의​​ MG 당 mitochondrial 복잡한 활동을 얻을 것입니다. mitochondrial 단백질의 농도는이 비교를하기 위해 정화 후 결정이 필요합니다. 또한, 다른 절연 버퍼이 접근 방식이 필요할 수 있습니다. 순수 mitochondrial 막 분획의 solubilization 들어, 아래의 단계 6 다음의 참고를 참조하십시오. </li><li> 얼음 차가운 solubilization 버퍼 (50mM NaCl, 50mM 이미다졸 / HCL 산도 7.0, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2mM 6 aminohexanoic 산성)과 vortexing하여 얼음에 원유 mitochondrial 펠렛을 Solubilize. 6 - aminohexanoic 산성은 1X 테아제 억제제 칵테일로 교체할 수 있습니다. 펠렛 중량의 20mg 당 solubilization 버퍼의 35μl를 사용하십시오. 10% 펠렛 중량 및 튜브를 flicking하여 믹스 20mg 당 W / V digitonin의 20μl를 추가합니다. 얼음 5-10 분 알을 품다. Dodecyl - BD - maltoside 또는 트리톤 X - 100은 단백질을 solubilize하는 digitonin에 대한 대체하실 수 있습니다. 세제 및 수량의 선택은 supercomplexes 또는 mitochondrial 단지의 multimeric 형태의 형성에 영향을 줄 수 있습니다. 자세한 내용은 ref.1를 참조하십시오. 참고 : 순수한 mitochondrial 막 분획을 solubilize에 필요한 세제의 수량 2~6그램 / G. 이르는 세제 / 단백질 무게 비율에 해당하는 mitochondrial 세포막을 solubilize하는 최적의 비율이 dodecyl - BD - maltoside에 대한 G / 2.5G이며, 대한 3g / G 트리톤 X - 100과 6g / digitonin에 대한 g. </li><li> 4 15 분 ° C.에 대한 10만그램에서 solubilized 펠릿을 원심 분리기 맑은 뜨는를 수집합니다. </li><li> 최종 5% W / V 글리세롤과 0.01 % W / V 개양귀비빛의 S (50 % W / V 글리세롤, 0.1 % W / V 개양귀비빛의 S 로딩 버퍼 재고 솔루션을 사용)에 버퍼를 로드할 추가합니다. </li><li> 레인 당 원유 mitochondrial 펠릿 20 - 40mg이 들어있는 볼륨 젤 우물을로드합니다. 3.5 %가 젤 스태킹있는 아크릴 아미드 기울기 젤 (4 -13 %)를 사용합니다. 참고 : 젤 준비와 전기 영동 조건 : bisacrylamide의 아크릴 아미드와 1.5g (49.5 % T, T는 AA와 bisAA와 C의 총 농도는 3% C.가의 48g : 겔 준비, 다음과 같은 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 (AA / bisAA) 3 믹스를 사용하여 총 단량체로 crosslinker (bisAA)의 비율). 젤 버퍼 (3 &#39;) : 1.5M 6 - aminohexanoic 산성, 75mM 이미다졸, 산도 7.0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> 그라데이션 젤 : </td><td> 4퍼센트 </td><td> 13% </td><td> 젤 스태킹 : </td><td> 3.5 % </td></tr><tr><td> AA / bisAA 세 믹스 </td><td> 2 ML </td><td> 6.5 ML </td><td></td><td> 0.6 ML </td></tr><tr><td> 젤 버퍼 3 &#39; </td><td> 8.3 ML </td><td> 8.3 ML </td><td></td><td> 2.7 ML </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td></td><td> 5g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14.7 ML </td><td> 5 ML </td><td></td><td> 4.7 ML </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> 25 ML </td><td> 25 ML </td><td></td><td> 8 ML </td></tr><tr><td> 10 % APS </td><td> 139 μl </td><td> 125 μl </td><td></td><td> 67 μl </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 μl </td><td> 12.5 μl </td><td></td><td> 6.7 μl </td></tr></tbody></table> 양극 버퍼 : 25mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0 음극 버퍼 : 50mM Tricine, 7.5mM 이미다졸 / HCL, 0.02 % W / V dodecyl - BD - maltoside, 0.05 % W / V deoxycholate, 산도 7.0 기름을 붓고 감기 방 (4-7 ° C)에서 젤을 실행합니다. 사용되는 초기 전압은 100V입니다. 예제는 스태킹 젤 입력되면, 전압은 15mA (0.15 &#39;14&#39;14 cm 젤)로 현재 제한과 500V 증가합니다. 전기 영동은 붉은 개양귀비빛의 S 염료의 날카로운 라인이 젤 전면에 접근 3-4 H 후에 중지됩니다. 또는 젤은 70 100V에서 일정한 전압 밤새 실행할 수 있습니다. <ol><li> 인 겔 활동 assays. 각 분석에 대한 부화의 시간은 단백질 solubilization의 효율성과 잘 당 로드된 자료의 양에 따라 달라집니다. 단지 I, IV 및 V는 일반적으로 단지 II 및 III보다 강한 신호를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 콤플렉스 I (CI) 몇 시간 동안 실온에서 CI 버퍼 (2.5mg/ml NBT,, 0.1mg/ml NADH 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4)로 겔 슬라이스를 품어. CI 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 : 0.01g NADH 0.25g NBT 15-45 분의 50 %와 10 %의 메탄올 초산에​​서 젤 수정. 고정 젤은 10% 초산에 보존되어 있습니다. 콤플렉스 II (CII) 몇 시간 동안 실온에서 CII 버퍼 (5mM 트리스 - HCL pH는 7.4, 0.2mM phenazine의 methasulfate,, 2.5mg/ml NBT succinate 20mM 나트륨)로 겔 슬라이스를 품어. CII 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 : 200μl 1M 나트륨 succinate 80μl의 phenazine의 methasulfate (250mM PMS는 DMSO에 용해) 0.25g NBT 처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정 콤플렉스 III (CIII) 상온에서 몇 시간 동안, CIII 버퍼 (0.05 % 3,3 &#39;- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB) 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어. CIII 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 : 50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride 처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정 콤플렉스 IV (문학) 몇 시간 동안 실온에서, 문학 버퍼 (0.05 % 3,3 &#39;- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB), 50μM 말을 마음 시토크롬 C 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어. 문학 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 : 50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride 0.1g 말을 마음 시토크롬 C 처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정 콤플렉스 V (CV) CV 버퍼 (35 밀리 트리스베이스, 270mM 글리신, 25 pH를 8.3 ° C, 14mM MgSO 4, 0.2 % W / V PB (NO 3) 2, 필름 ATP) 몇 시간 동안 실온에서.로 겔 슬라이스를 품어 CV 버​​퍼 : 솔루션의 당 100ml 추가 : <table border="0"><tbody><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> PB (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> 산도를 (8.3 있어야합니다) 조정 필요 - 산성이나베이스를 사용하지 마십시오. 필터 추가 <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> 30 분 50 % 메탄올에서 젤를 수정하고 물을 전송할 수 있습니다.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포, 높은 해상도 명확한 기본 겔 전기 영동 (hrCNE)하여 분리하고, 인 겔 촉매 활동 assays에 의해 이후의 분석에서 mitochondrial 단백질 단지의 추출을 설명합니다. hrCNE 파란색 기본 겔 전기 영동의 비교 해상도 mitochondrial 막 단백질 단지를 해결 및 - 겔 활동 assays를위한 우수합니다. 이 기술은 mitochondrial 호흡 단지 IV를 정할뿐만 아니라 hESCs과 그들의 유도체 자손 모두에 어떤 mitochondrial 막 단백질 복합의 subunit 구성을 분석할뿐만 아니라 고용 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>NaOH로 pH를 8.0으로 조정</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1M Sodium succinate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 및 BP329-1</td><td>1M Na2HPO4 68.4 ml와 1M NaH2PO4 31.6 ml를 혼합하여 25 C에서 pH 7.2의 0.1M sodium phosphate buffer를 제조</td></tr><tr><td>1M Tricine, pH 7.0 (NaOH로 조정)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>4 C에서 보관</td></tr><tr><td>1M imidazole/HCl, pH 7.0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>4 C에서 보관</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>물에 용해. 1 ml씩 분주하여 &amp;#8211;20 C에서 보관.</td></tr><tr><td>10% (wt/vol) digitonin (&amp;gt;50% 순도, 재결정 없이 사용)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>물에 용해. 0.1&amp;#8211;1 ml씩 분주하여 &amp;#8211;20 C에서 보관. 사용 전 95 C로 가온해야 함.</td></tr><tr><td>2M 6-aminohexanoic acid</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>4 C에서 보관</td></tr><tr><td>10x Ponceau S/glycerol 스탁 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 및 G6279-1L</td><td>물에 0.1% Ponceau S, 50% glycerol (wt/vol) 포함.</td></tr><tr><td>10% w/v sodium deoxycholate</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>물에 용해. 빛으로부터 보호해야 함. HCl로 pH를 7.0으로 조정하고 여과 후 실온에서 보관.</td></tr><tr><td>250 mM phenazine methasulfate (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>DMSO에 용해 후 분주. &amp;#8211;20 C에서 보관.</td></tr><tr><td>Nitro-blue tetrazolium (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate disodium salt (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Grade I, 최소 99%</td></tr><tr><td>beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) 환원형</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>말 심장 유래 Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>&amp;#8211; 20 C에서 보관.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 염색액 0.4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x Trypsin (0.5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Inhibitor</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 배아 줄기 세포에서 mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria 세포질 세포의 대사 및 항상성에 주요 역할을 organelles, 세포 신호 네트워크의 규제 및 프로그램 세포 사망 있습니다. Mitochondria 생산 ATP는 세포질 산화 환원 상태와 Ca2 + 균형을 조절 지방산을 catabolize, 헴, 세포핵, 스테로이드 호르몬, 아미노산을 합성하고, 단백질의 철 - 유황 클러스터를 조립 도움이됩니다. Mitochondria는 열 생산에 필수적인 역할을했습니다. mitochondrial 게놈의 변이는 인간의 장애 여러 종류의 원인이됩니다. mtDNA 변이의 축적이 노화와 상호 및 암의 개발에 중요한 역할을 가지고 의심됩니다. 모든 세포 유형에서 극히 중요한 역할로 인해, mitochondria의 기능은 또한 줄기 세포에 중요합니다. 주요 진보는 줄기 세포 생존, 증식 및 분화 능력에 대한 우리의 이해에되었습니다. 그러나 줄기 세포의 기능 활동은, 특히 그들의 에너지 상태, 아직 자세히 연구되지 ​​않았습니다. 거의 아무것도 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 그들의 차별화된 전구체 자손의 mitochondrial 속성에 대한 알려진되지 않습니다. hESC 기능과 발달 가능성에 mitochondria의 역할을 이해하고 평가하는 한 가지 방법은 직접 mitochondrial 호흡 단지의 활동을 측정하는 것입니다. 여기, 우리는 hESCs의 다섯 호흡기 체인 단지를 분석하는 방법으로 젤 활동 시각화의 고해상도 명확한 기본 겔 전기 영동과 이후에 대해 설명합니다.

이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

미토콘드리아는 세포 대사와 항상성 유지, 세포 신호 전달 네트워크 조절 및 ... 등에 주요한 역할을 하는 세포질 소기관입니다.

미토콘드리아는 대사와 에너지 생산부터 세포 사멸 프로그램, 스테로이드 호르몬 합성에 이르기까지 세포 생리에서 수많은 역할을 수행합니다. 기본적인 세포 기능과 질병 모두에서 미토콘드리아가 갖는 중요성에도 불구하고, 인간 배아줄기세포 및 그 분화 후손 세포 내 미토콘드리아의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 본 영상에서는 인겔(Ingel) 활성 분석법을 사용하여 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아 호흡쇄 복합체를 분석하는 방법을 보여드리겠습니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 병리학 및 실험의학과의 Michael Tetel 교수 연구실 소속 Ivan OV입니다. 오늘은 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아 호흡 복합체 기능을 평가하는 절차를 보여드리겠습니다. 이 젤 내 활성 측정 절차에는 인간 배아줄기세포로부터 조 미토콘드리아 팰릿을 분리하는 과정, 고해상도 clear native polyacrylamide 젤 전기영동을 통해 산화적 인산화 시스템의 미토콘드리아 복합체를 분리하는 과정, 그리고 이어지는 젤 내 활성 측정 단계가 포함됩니다.이제 시작하겠습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 인간 배아줄기세포에서 미토콘드리아를 분리하는 것입니다. 본 분석에서는 피더 프리(feeder-free) 조건에서 마트리젤(matrigel)이 코팅된 플레이트에서 배양한 인간 배아줄기세포를 사용하겠습니다.인간 amry 줄기세포에서 미토콘드리아를 수집하기 위해, 먼저 따뜻한 1X PBS pH 7.4로 세포를 세척한 다음 5분 동안 트립신 처리(trypsinization)를 수행합니다. 6웰 플레이트의 웰당 1 mL의 1X trypsin을 사용할 수 있습니다. 5분 후, 1 mg/mL의 트립신 억제제가 포함된 1X PBS를 동일한 부피로 첨가하여 반응을 중단시키고 세포를 수확합니다.수집한 세포를 상온에서 200 ×g로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 1 × protease inhibitor가 포함된 갓 제조한 칵테일이 들어있는 0.8 ~ 1.7 mL의 ice cold mitochondria isolation buffer에 펠릿화된 세포를 다시 현탁합니다. 사용하는 버퍼의 양은 얻어진 세포 펠릿의 크기에 따라 달라집니다. 펠릿을 재현탁한 후, 얼음 위에서 약 10분간 배양합니다.배양 후 호모게나이저(homogenizer)를 사용하여 세포를 파쇄하며, 이때 약 40~50회 정도 반복합니다. DOD 세포의 일부를 트라이판 블루(trypan blue)로 염색하여 광학 현미경으로 관찰함으로써 균질화가 완전히 이루어졌는지 확인할 수 있습니다. 그 모습은 다음과 같아야 합니다.이것은 다운즈(downs)를 사용하여 50회 스트로크한 후의 첫 번째 모습입니다. 이것은 80회 스트로크한 후의 두 번째 모습입니다. 세포가 균질화되면, 4 °C에서 20,000 ×g로 10분 동안 원심분리하십시오. 이를 통해 핵과 더 큰 세포 파편이 포함된 조밀한 미토콘드리아 펠렛을 얻을 수 있습니다.펠릿을 수집하기 전에, 이후의 펠릿 무게를 추정하기 위해 수집 튜브의 무게를 측정하고, 상층액을 따라내어 버린 다음, 침전된 조 미토콘드리아 펠릿의 무게를 측정해야 합니다. 이 시점에서 튜브의 무게를 빼면 다음 단계에서 보여줄 펠릿 가용화 단계를 진행할 수 있습니다. 조 미토콘드리아 펠릿을 가용화하기 위해, 먼저 펠릿을 얼음에 유지하며 35 µL의 차가운 가용화 버퍼와 함께 볼텍싱하는 것으로 시작합니다.상세 정보가 제공된 펠렛 20 mg당 사용되는 버퍼 화합물은 동봉된 서면 프로토콜에 명시되어 있습니다. 볼텍싱 후 가용화 버퍼를 첨가하고 디지토닌(digitonin)을 넣기 전, 재현탁된 펠렛을 고속 원심분리에 적합한 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 펠렛 무게 20 mg당 10% (w/v) 디지토닌 20 µL를 첨가하고 튜브를 튕겨 섞어줍니다. 충분히 혼합된 후 미토콘드리아 펠렛을 얼음 위에서 5~10분 동안 배양합니다. 단백질을 가용화하기 위해 디지토닌 대신 n-dodecyl-β-D-maltoside(DDM) 또는 Triton X-100을 사용할 수 있습니다.계면활성제의 종류와 양은 얼음 위에서 배양한 후 미토콘드리아 복합체의 상위 복합체(supra complexes) 또는 다량체 형태의 형성에 영향을 미칠 수 있습니다. 펠렛이 가용화되면 4 °C에서 100,000 ×g로 15분 동안 원심분리한 후, 투명한 상층액을 수집합니다. 이제 미토콘드리아의 네이티브 구배 겔 전기영동을 위해 상층액을 구배 겔에 로딩할 준비가 되었습니다.3.5% 스태킹 젤(stacking gel)과 5~13% 아크릴아마이드 구배 젤(acrylamide gradient gel)의 사용을 권장합니다. 젤을 제조하기 위해, 서면 프로토콜에 기술된 대로 아크릴아마이드-비스-아크릴아마이드 혼합물을 사용하겠습니다. 아크릴아마이드-비스-아크릴아마이드 용액은 미리 제조하여 4°C의 암소에 보관합니다.Acrylamide과 bis acrylamide는 분말 및 액체 상태 모두에서 독성 화학 물질이므로, 이를 다룰 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. Acrylamide bis acrylamide 용액을 1.5 molar 6-aminohexanoic acid와 75 millimolar olet(pH 7.0)으로 구성된 3x gel buffer의 일정량과 혼합합니다. buffer에 첨가하는 acrylamide bis acrylamide 용액의 양은 gradient gel 제작 시 설정하는 gel의 퍼센트 농도에 따라 달라집니다.4% 혼합액 하나와 13% 혼합액 하나를 만들고, 스태킹 젤(stacking gel)은 3.5% 혼합액으로 준비합니다. 13% 혼합액에 글리세롤을 추가하는 것을 잊지 마십시오. 세 가지 혼합액이 모두 준비되면, 각 혼합액에 적절한 양의 과황산암모늄(ammonium per sulfate)과 TEMED를 첨가하고 이를 그라디언트 형성 캐스팅 챔버(gradient former casting chamber)에 붓습니다.챔버의 왼쪽 부분에는 5% 혼합액이 들어있습니다. 챔버의 오른쪽 부분에는 소형 자석 교반 바와 함께 13% 혼합액이 들어있습니다. 챔버의 오른쪽 부분을 열어 겔을 붓기 시작합니다.그런 다음 즉시 챔버의 왼쪽 부분을 열어 5% 용액과 13% 용액을 혼합하여 구배를 형성합니다. 중합 후 겔의 경계선이 날카롭고 직선으로 형성되도록 겔 상단에 소량의 이소프로판올을 추가합니다. 약 1시간 후 구배 겔의 중합이 완료되면, 이소프로판올을 제거하고 3.5 스태킹 겔을 장치에 붓고 겔 콤을 삽입합니다.약 4~7°C의 저온실에서 젤을 조립하고 전기영동을 수행하겠습니다. 이 젤을 실행하기 위해 두 가지 서로 다른 완충액을 사용합니다. 양극 챔버에는 25 millimolar hydrochloric acid pH 7.0이 포함된 완충액을 사용합니다.음극 완충액은 50 mM Tris, 7.5 mM HCl, 0.02% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside(DDM) 및 0.05% (w/v) desoxy cholate (pH 7.0)를 포함합니다. 방금 제작한 겔에서 전기영동할 상층액을 준비하기 위해, 최종 농도가 5% (w/v) glycerol 및 0.01% (w/v) Ponto S가 되도록 로딩 완충액을 추가합니다. 일반적으로 glycerol과 Ponto S가 포함된 10x 스톡 용액을 상층액에 직접 첨가합니다.이제 젤 샘플을 젤에 로딩할 준비가 되었습니다. 레인당 20 ~ 40 mg의 조 mitochondrial 단백질이 포함된 부피로 젤 웰을 로딩합니다. 로딩 직후, 젤을 100 V에서 전기영동합니다.시료가 스태킹 젤(stacking gel)에 진입하면, 전류를 15 milliamps로 제한한 상태에서 전압을 500 volts까지 높일 수 있습니다. 일반적으로는 70 to 100 volts에서 밤새도록 젤을 전기영동하지만, 붉은색 zos 염료의 선명한 라인이 젤 전면(gel front)에 도달하면 전기영동을 중단합니다. 젤 실행이 완료되었으므로, 이제 젤 내에서 서로 다른 단백질 복합체의 활성을 직접 분석할 수 있습니다.각 분석의 배양 시간은 단백질 가용화 효율과 웰당 로딩된 시료의 양에 따라 달라집니다. 일반적으로 복합체 1, 4, 5는 복합체 2, 3보다 더 강한 신호를 나타냅니다. 따라서 복합체 2와 3의 염색 시간은 더 길게 설정해야 합니다.복합체 활성을 테스트하려면 각 복합체에 맞는 특정 버퍼를 사용해야 합니다. 개별 버퍼의 성분은 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 이제 In-gel 활성 분석을 각각 수행하기 위해 겔의 개별 레인을 절단하겠습니다.복합체 5를 제외한 모든 복합체의 경우, 겔 슬라이스를 각각의 버퍼에 넣고 실온에서 수 시간 동안 배양합니다. 배양 후, 50% methanol과 10% acetic acid에서 15~45분 동안 겔을 고정합니다. 고정된 겔은 10% acetic acid에 보관합니다.여기에서 복합체 1의 염색 결과가 어떻게 나타나는지 확인할 수 있습니다. 겔 슬라이스 내의 짙은 보라색 밴드 하나가 복합체 1에 해당합니다. 투명한 겔을 사용하면 미토콘드리아 복합체 활성으로부터 밀도 측정을 수행하고 비교 분석을 진행할 수 있습니다.고밀도 세포 분석 후, 일반적으로 겔 슬라이스를 건조하여 장기 보관하거나, 고품질 이미지를 얻기 위해 스캐닝을 수행합니다. 복합체 2는 복합체 3 및 복합체 4와 동일한 보라색으로 염색됩니다. 두 복합체 모두 오렌지색 또는 황색의 염색 밴드를 나타냅니다. 다음은 복합체 2, 3 및 4의 염색 활성 예시입니다.지금까지 인간 배아줄기세포에서 추출하고 네이티브 겔 전기영동을 포함한 고해상도 방법을 통해 분리한 미토콘드리아 삼출성 활성 복합체의 활성을 분석하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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