, 동결 해동 및 운송을위한 포장 셀

세포 배양은 매우 다양한 연구 및 진단 응용 분야에서 활용됩니다. 세포를 보존하고, 노화를 방지하며, 오염 위험을 줄이고, 유전적 드리프트의 영향을 최소화하기 위해 향후 작업을 위해 세포주를 저장하는 것이 바람직할 때가 있습니다. 세포주는 장기 보관을 위해 냉동될 수 있습니다.

이 영상에서는 단층 및 부유 배양으로 성장시킨 세포를 동결하는 방법과 다시 성장시키기 위해 해동하는 방법을 보여드립니다. 안녕하세요, 저는 이스트 테네시의 Molecular Pathology Laboratories Network 내 Dr.LAN 실험실의 Ricky입니다. 오늘은 장기 보관을 위해 세포를 동결하는 방법과 액체 질소에서 세포를 해동하는 방법을 보여드리겠습니다.

인체 부착 세포를 동결하려면, 우선 세포를 패키징할 때와 마찬가지로 플레이트에서 떼어내는 것부터 시작합니다. 동결 보존을 위해서는 세포가 대수 성장기(log phase)에 있을 때 사용하는 것이 가장 좋다는 점에 유의하십시오. 세포가 분리되고 혈청 또는 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신 반응을 중단시킨 후, 세포 현탁액을 멸균된 원심 분리 튜브로 옮기고 2mL를 추가합니다.

동일한 기원의 동일한 계대 배양에서 얻은 3개 이상의 디쉬에 담긴 혈청 포함 완전 배지 내 세포들을 하나의 튜브에 합칠 수 있습니다. 상온에서 300 내지 350 Gs로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 4 °C의 10 mL에 재부유합니다.

완전 배지에 4°C의 동결 배지를 동일한 부피로 첨가하고, 세포를 충분히 혼합한 후 튜브를 얼음에 박아 세포 수를 측정합니다. 헤모사이토미터를 사용하여, 거의 confluence 상태에 도달한 25 cm² 플라스크의 세포를 동결하기 위해 최종 세포 농도가 mL당 100만 개 또는 1,000만 개가 되도록 동결 배지로 현탁액을 더 희석합니다. 약 3 mL의 동결 배지에 다시 현탁하고, 세포 현탁액 1 mL씩을 라벨이 부착된 2 mL 크라이오 바이알에 분주합니다.

바이알의 캡을 확실히 조여주십시오. 바이알을 -80°C 냉동고에 1시간에서 하룻밤 동안 보관한 후, 액체 질소 저장 냉동고로 옮깁니다. 부유 배양 세포를 동결하는 원리는 단층 배양 세포를 동결하는 것과 유사합니다.

주요 차이점은 부유 배양의 경우 먼저 트립신 처리(trypsinization)를 할 필요가 없다는 점입니다. 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮긴 후 실온에서 300~350 G로 10분 동안 원심분리하십시오. 그다음, 상층액을 제거하고 펠릿을 4°C의 동결 보존액에 1 x 10⁶~10 x 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁하십시오.

그 다음 세포 현탁액 1 mL씩을 동결 보관 튜브에 옮겨 담고 동결합니다. 이전 장에서 설명한 단층 배양법과 동일한 방식으로, 동결된 튜브를 해동하고 회복시킵니다. 먼저, 액체 질소 냉동고에서 세포 튜브를 꺼내 즉시 37 °C 항온 수조에 넣습니다.

배지가 해동될 때까지 바이알을 지속적으로 흔들어 주십시오. 일반적으로 60초 미만이 소요됩니다. 해동이 완료되면 바이알 윗부분을 70% ethanol로 닦아낸 후 개봉하십시오. 그런 다음 해동된 세포 현탁액을 2 mL의 따뜻한 완전 배지와 20% fetal bovine serum centrifuge가 포함된 멸균 원심 분리 튜브로 옮기십시오.

상온에서 150~200 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 이 단계는 잔류 DMSO를 제거하기 위한 것이며, 원심분리 후 상층액을 버리고 세포 펠릿을 약 1 mL의 완전 배지와 20% FBS에 부드럽게 재현탁합니다. 이를 적절한 양의 배지가 들어 있는 라벨링 된 배양 플레이트로 옮깁니다. 일반적으로 5~20 mL의 배지에 1 mL의 세포 현탁액이 필요합니다.

이제 세포를 37°C 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 5~7일 후 또는 배지 내 pH 지표의 색이 변했을 때 세포가 플레이트에 잘 부착되었는지 확인한 후 배지를 교체해 줍니다. 세포주가 재확립될 때까지 20% FBS가 포함된 배지에서 배양을 유지하십시오.

회수율이 매우 낮은 경우, 원래 배양액의 일부 하위 집단만 성장하고 있을 가능성이 있습니다. 특히 모자이크 현상이 있는 것으로 알려진 세포주를 다룰 때 이 점에 유의하십시오. 배양물을 운송해야 하는 경우, 단층 배양과 부유 배양 모두 쉽게 운송할 수 있습니다.

25 cm 조직 배양 플라스크에서 세포를 단층으로 거의 합류(confluency) 상태까지 성장시키거나, 부유 상태로 원하는 밀도까지 성장시킵니다. 단층 배양의 경우, 먼저 배지를 제거한 후 플라스크에 신선한 배지를 채웁니다. 운반 중에 플라스크가 기울어지더라도 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 플라스크에 배지를 완전히 채우는 것이 필수적입니다.

부유 배양의 경우, 신선한 배지를 추가하여 플라스크를 채웁니다. 캡을 조인 후 파라필름(parafilm)을 사용하여 고정합니다. 플라스크는 누출 방지용 플라스틱 백이나 액체가 새는 것을 방지하도록 설계된 다른 밀폐 용기에 넣어 밀봉합니다.

플라스크가 손상될 경우를 대비하여, 운송 중 극단적인 온도 변화로부터 보호하기 위해 1차 용기를 2차 단열 용기에 넣습니다. 패키지 외부에 생물학적 위험 표시 라벨을 부착합니다. 일반적으로 배양물은 당일 야간 또는 익일 배송 서비스를 통해 운송됩니다.

지금까지 부착 세포와 부유 세포 모두에 대해 인간 세포 배양액을 동결하고 해동하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 모든 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.