Name: , 동결 해동 및 운송을위한 포장 셀 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 포유류 세포의 동결 및 해동 기술을 세포 생물학 연구를 위해. 단층 및 현탁 세포를 액체 질소에 저장하고 복원하는 실용적인 방법을 익혀 실험의 재현성을 높이세요.

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이 실험 방법에 대한 전체 텍스트 프로토콜에서 사용할 수 있습니다 <a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract">셀 생물학의 현재 프로토콜.</a>

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, 동결 해동 및 운송을위한 포장 셀

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

교양 포유 동물 세포는 세포 생물학 연구에서 광범위하게 사용됩니다. 이것은 구조, 기능, 행동, 문화에있는 세포의 생물을 보존하기 위해서는 특별한 기술의 번호를 필요로합니다. 이 동영상은 세포 및 냉동 주식을 복구할을 동결하고 저장하는 데 필요한 기본 기술을 설명합니다.

교양 포유 동물 세포는 세포 생물학 연구에서 광범위하게 사용됩니다. 이 동영상은 세포 및 냉동 주식을 복구할을 동결하고 저장하는 데 필요한 기본 기술을 설명합니다.

배양된 포유류 세포는 세포 생물학 연구에서 광범위하게 사용됩니다. 이를 보존하기 위해서는 여러 가지 특수한 기술이 필요합니다.

세포 배양은 매우 다양한 연구 및 진단 응용 분야에서 활용됩니다. 세포를 보존하고, 노화를 방지하며, 오염 위험을 줄이고, 유전적 드리프트의 영향을 최소화하기 위해 향후 작업을 위해 세포주를 저장하는 것이 바람직할 때가 있습니다. 세포주는 장기 보관을 위해 냉동될 수 있습니다.이 영상에서는 단층 및 부유 배양으로 성장시킨 세포를 동결하는 방법과 다시 성장시키기 위해 해동하는 방법을 보여드립니다. 안녕하세요, 저는 이스트 테네시의 Molecular Pathology Laboratories Network 내 Dr.LAN 실험실의 Ricky입니다. 오늘은 장기 보관을 위해 세포를 동결하는 방법과 액체 질소에서 세포를 해동하는 방법을 보여드리겠습니다.인체 부착 세포를 동결하려면, 우선 세포를 패키징할 때와 마찬가지로 플레이트에서 떼어내는 것부터 시작합니다. 동결 보존을 위해서는 세포가 대수 성장기(log phase)에 있을 때 사용하는 것이 가장 좋다는 점에 유의하십시오. 세포가 분리되고 혈청 또는 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신 반응을 중단시킨 후, 세포 현탁액을 멸균된 원심 분리 튜브로 옮기고 2mL를 추가합니다.동일한 기원의 동일한 계대 배양에서 얻은 3개 이상의 디쉬에 담긴 혈청 포함 완전 배지 내 세포들을 하나의 튜브에 합칠 수 있습니다. 상온에서 300 내지 350 Gs로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 4 °C의 10 mL에 재부유합니다.완전 배지에 4°C의 동결 배지를 동일한 부피로 첨가하고, 세포를 충분히 혼합한 후 튜브를 얼음에 박아 세포 수를 측정합니다. 헤모사이토미터를 사용하여, 거의 confluence 상태에 도달한 25 cm² 플라스크의 세포를 동결하기 위해 최종 세포 농도가 mL당 100만 개 또는 1,000만 개가 되도록 동결 배지로 현탁액을 더 희석합니다. 약 3 mL의 동결 배지에 다시 현탁하고, 세포 현탁액 1 mL씩을 라벨이 부착된 2 mL 크라이오 바이알에 분주합니다.바이알의 캡을 확실히 조여주십시오. 바이알을 -80°C 냉동고에 1시간에서 하룻밤 동안 보관한 후, 액체 질소 저장 냉동고로 옮깁니다. 부유 배양 세포를 동결하는 원리는 단층 배양 세포를 동결하는 것과 유사합니다.주요 차이점은 부유 배양의 경우 먼저 트립신 처리(trypsinization)를 할 필요가 없다는 점입니다. 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮긴 후 실온에서 300~350 G로 10분 동안 원심분리하십시오. 그다음, 상층액을 제거하고 펠릿을 4°C의 동결 보존액에 1 x 10⁶~10 x 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁하십시오.그 다음 세포 현탁액 1 mL씩을 동결 보관 튜브에 옮겨 담고 동결합니다. 이전 장에서 설명한 단층 배양법과 동일한 방식으로, 동결된 튜브를 해동하고 회복시킵니다. 먼저, 액체 질소 냉동고에서 세포 튜브를 꺼내 즉시 37 °C 항온 수조에 넣습니다.배지가 해동될 때까지 바이알을 지속적으로 흔들어 주십시오. 일반적으로 60초 미만이 소요됩니다. 해동이 완료되면 바이알 윗부분을 70% ethanol로 닦아낸 후 개봉하십시오. 그런 다음 해동된 세포 현탁액을 2 mL의 따뜻한 완전 배지와 20% fetal bovine serum centrifuge가 포함된 멸균 원심 분리 튜브로 옮기십시오.상온에서 150~200 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 이 단계는 잔류 DMSO를 제거하기 위한 것이며, 원심분리 후 상층액을 버리고 세포 펠릿을 약 1 mL의 완전 배지와 20% FBS에 부드럽게 재현탁합니다. 이를 적절한 양의 배지가 들어 있는 라벨링 된 배양 플레이트로 옮깁니다. 일반적으로 5~20 mL의 배지에 1 mL의 세포 현탁액이 필요합니다.이제 세포를 37°C 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 5~7일 후 또는 배지 내 pH 지표의 색이 변했을 때 세포가 플레이트에 잘 부착되었는지 확인한 후 배지를 교체해 줍니다. 세포주가 재확립될 때까지 20% FBS가 포함된 배지에서 배양을 유지하십시오.회수율이 매우 낮은 경우, 원래 배양액의 일부 하위 집단만 성장하고 있을 가능성이 있습니다. 특히 모자이크 현상이 있는 것으로 알려진 세포주를 다룰 때 이 점에 유의하십시오. 배양물을 운송해야 하는 경우, 단층 배양과 부유 배양 모두 쉽게 운송할 수 있습니다.25 cm 조직 배양 플라스크에서 세포를 단층으로 거의 합류(confluency) 상태까지 성장시키거나, 부유 상태로 원하는 밀도까지 성장시킵니다. 단층 배양의 경우, 먼저 배지를 제거한 후 플라스크에 신선한 배지를 채웁니다. 운반 중에 플라스크가 기울어지더라도 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 플라스크에 배지를 완전히 채우는 것이 필수적입니다.부유 배양의 경우, 신선한 배지를 추가하여 플라스크를 채웁니다. 캡을 조인 후 파라필름(parafilm)을 사용하여 고정합니다. 플라스크는 누출 방지용 플라스틱 백이나 액체가 새는 것을 방지하도록 설계된 다른 밀폐 용기에 넣어 밀봉합니다.플라스크가 손상될 경우를 대비하여, 운송 중 극단적인 온도 변화로부터 보호하기 위해 1차 용기를 2차 단열 용기에 넣습니다. 패키지 외부에 생물학적 위험 표시 라벨을 부착합니다. 일반적으로 배양물은 당일 야간 또는 익일 배송 서비스를 통해 운송됩니다.지금까지 부착 세포와 부유 세포 모두에 대해 인간 세포 배양액을 동결하고 해동하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 모든 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 우리 연구소 색채 인간의 배아 줄기 세포 라인을 멈추 방법을 보여줍니다.

냉동 인간 ES 세포

제임스 톰슨 외 문화에 hES을 분리하고 성장 1998 년 기술을 개발 때문에, 나중에 사용하기 위해 및 냉동 주식에서 세포를 해동 및 확대 냉동 세포는 일상 hES 세포 배양에서 수행한 중요한 절차가있다. hES 세포는 동결 융해의 스트레스에 민감하고 있으므로 특별한주의가 있어야합니다. 여기 우리는 신속하게, 액체 질소 주식에서 hES 세포를 해동 마우스 배아 피더 세포를 도금하고, 천천히 장기 저장을 위해 그들을 오해해서 적절한 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포를 동결 융해

가까운 원시 상태에서 세균 세포의 ultrastructure 연구를 전자 cryotomography (요법)를 사용하는 방법을 우리는 "macromolecular"(~ 4 NM) 해상도, 여기를 보여줍니다.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

동결 건조는 종종 실행 가능한 세균 세포의 건조 제품을 얻을 수있는 쉽고 편리한 방법입니다. 프로세스의 문제는 세포의 생존이다. 여기에 우리가 세부 동결 건조하는 동안 세포의 생존을 사용 제형의 특성에 의해 영향을하는 방법을 조사하는 절차입니다.

세포 생존에 박테리아와 그 영향의 동결 건조 공법

고품질 투과 전자 현미경 이미지를 얻는 것은 특히 물이 채워진 큰 액포와 폭기 공간이 풍부한 식물 세포의 경우 어렵습니다. 직렬 고압 동결 및 급속 동결 대체는 TEM을 위한 식물 샘플의 준비 시간을 크게 단축하는 동시에 탁월한 초구조 보존력을 가진 샘플을 생성합니다.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

이 논문은 투과형 전자 현미경으로 현탁 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 cryofixation 방법을 설명한다.

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

Drosophila 셀 라인은 기본 및 생물 의학 연구를 위한 중요 한 시 약. 이 문서는 녹고, subculturing, 및 그들의 연구에서이 약의 사용을 통합 연구원을 지원 하기 위해 일반적으로 사용 되 초파리 셀 라인의 cryopreservation 프로토콜을 제공 합니다.

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

여기서, 25 nm 하프 피치의 해상도로 전체 냉동 보존된 세포의 초구조를 이미지화하기 위해 냉동 소프트 X선 단층촬영(SXT)에 필요한 샘플 준비 및 데이터 수집 단계를 기술하는 프로토콜이 제시된다.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

여기서 우리는 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리 된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 샌드위치 동결 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 급속한 동결 후에 초박단면도를 위한 견본을 준비하는 방법을 보여줍니다.

전자 현미경 검사에서 생물학적 표본의 좋은 초구조 보존을 위한 샌드위치 동결 장치를 사용하여 급속한 동결

여기에서는 초저온 전자 단층 촬영을 위한 세포 샘플 준비를 안내하는 3D 상관 집속 이온 빔 밀링을 위한 파이프라인을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 관심 단백질의 3D 위치는 먼저 극저온 형광 현미경으로 측정한 다음 밀링을 대상으로 합니다. 이 프로토콜은 포유류, 효모 및 박테리아 세포에 적합합니다.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

배우세요 포유류 세포의 동결 및 해동 기술을 세포 생물학 연구를 위해. 단층 및 현탁 세포를 액체 질소에 저장하고 복원하는 실용적인 방법을 익혀 실험의 재현성을 높이세요.

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