인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 리버사이드 캠퍼스 생화학과의 Frank Zawa 박사님 연구실 소속 Stefan Burani입니다. 오늘은 염색질 면역침전법 절차를 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

본 절차는 인간 배아 줄기세포의 포름알데히드 가교 결합으로 시작됩니다. 가교 결합 전, 인간 배아 줄기세포를 액체 질소에서 37 °C로 5분 동안 해동한 후 배지로 세척합니다. 그 다음, 세포를 젤라틴이 코팅된 6-웰 플레이트에 분주하고 2~3일 동안 증식시킵니다.

각 면역침전 반응을 위해 5,000만에서 1억 개의 세포로 시작해야 합니다. 먼저 세포를 분해하여 현탁액 상태로 수집합니다. 각 세포 현탁액에 1% 농도의 신선한 aldehyde를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

다음으로, 포름알데히드를 중화시키기 위해 1.25 M 글리신을 전체 부피의 1/10만큼 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 10 mL의 PBS로 세포를 두 번 가볍게 섞어준 후, 50 mL 원추형 튜브에 옮깁니다. 세포를 펠릿 형태로 수집하기 위해 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 1000 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 상층액을 제거하고 펠릿을 1.5 milliliters의 lyce buffer에 재현탁합니다. 마지막으로 세포를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 이동이 완료되면 액체 질소에서 세 번 급속 냉동시킨 후, 조직 분쇄기를 사용하여 세포를 파쇄합니다.

세포 가교 결합이 완료되면 면역침전법을 수행하거나 -80 °C에서 무기한 냉동 보관할 수 있습니다. 세포 가교 결합 후에는 이를 수행하기 위해 자성 비드를 준비해야 합니다. 1.5 mL 저흡착 마이크로 튜브에 DI 비드 50 µL를 넣어 면역침전법 1회당 비드 튜브 1개를 준비하십시오.

그 다음 블록 용액 1 mL를 추가합니다. 이제 dyal MPC를 사용하여 dyal 비드를 수집합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 넣습니다.

비드가 튜브 측면에 모이도록 합니다. 약 15초 정도 소요됩니다. 비드가 잘 모이도록 랙을 두 번 뒤집어도 좋습니다.

비드를 수집한 후, 피펫으로 상층액을 제거합니다. 상층액을 제거한 후, 블로킹 용액 1 mL를 첨가하고 랙에서 마그네틱 스트립을 분리한 뒤 랙을 뒤집어 비드를 부드럽게 재부유시킵니다. 튜브를 고정한 상태로 이 과정을 10~20회 또는 비드가 균일하게 섞일 때까지 반복합니다.

이전과 동일한 방법으로 비드를 재현탁하여 수집하십시오. 수집이 완료되면 피펫으로 상층액을 제거합니다. 1.5 milliliters의 블로킹 용액을 사용하여 이 세척 과정을 반복하십시오.

두 번째 세척 후, 750 µL의 블로킹 용액으로 비드를 재현탁한 다음 10 µg의 항체를 추가합니다. 본 연구에서는 MLL 단백질에 대한 항체를 사용하여 혼합물을 4 °C에서 최소 6시간 또는 오버나이트로 로테이터에서 배양합니다. 이 배양 과정 동안 크로스링크된 염색질을 초음파 처리할 수 있으며, 이에 대해서는 오버나이트 배양 직후에 시연하겠습니다.

항체 용액을 제거한 후 비드를 3회 세척하십시오. 이전과 동일하게 1 mL의 lyase 버퍼를 사용하고, 자석 랙을 이용하여 비드를 수집합니다. 세척이 완료되면 포화된 크로마틴을 추가할 준비가 된 것입니다.

초음파 처리를 시작하기 전, 먼저 -80°C에서 냉동된 세포 펠릿을 꺼내 해동시킵니다. 초음파 처리를 위해 15mL 원추형 튜브를 준비합니다. 이는 튜브의 5mL 표시 지점에서 두 조각으로 자른 후 윗부분을 버려 준비합니다.

튜브는 파라필름이나 튜브 캡으로 덮을 수 있습니다. 준비 과정에서 튜브 랙을 사용하여 ator 프로브가 튜브 바닥에서 약 0.5에서 1cm 위에 위치하도록 튜브를 배치하십시오.

용액의 거품 발생을 방지하기 위해 프로브가 중앙에 위치하고 튜브 벽면에 닿지 않도록 주의하십시오. 이제 현탁액을 20초씩 6회 초음파 처리하십시오. 거품 발생을 줄이기 위해 각 샘플은 초음파 처리 회차 사이에 얼음물 배스에 보관해야 합니다.

처음에는 출력 전력을 0으로 설정한 다음, 첫 번째 버스트(burst) 동안 최종 전력까지 수동으로 증가시킵니다. 일정 시간 후, 시료를 1.5 mL 튜브로 옮기고 4 °C에서 13,000 RPM으로 10분 동안 원심분리합니다. 이는 잔해물을 침전시키고 상층액을 수집하기 위함입니다.

SINA를 새로운 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 각 샘플의 세포 용해물 50 microliters를 input DNA로 보관하십시오. 이는 나중에 공유 염색질의 크기를 확인하는 데 사용됩니다.

이는 영하 20°C에서 보관할 수 있습니다. 초음파 처리된 용해물 배치당 최소 하나 이상의 입력 DNA 분주액을 보관해야 합니다. 이제 크로마틴을 면역침강시킬 준비가 되었습니다.

먼저, 이전 단계에서 수집한 5,000만에서 1억 개의 세포에 해당하는 염색질을 앞서 준비한 50 µL의 항체 자성 비드 혼합물에 넣고 최종 부피가 1 mL가 되도록 합니다. 필요한 경우, lysis 버퍼를 사용하여 이 부피를 조절한 후, 비드를 재현탁시키기 위해 뒤집어 섞어줍니다. 이 혼합물을 4 °C의 냉장고에서 하룻밤 동안 배양합니다.

인큐베이션 후, dyl MPC를 사용하여 비즈를 수집하고 튜브를 랙에 배치하여 비즈가 튜브 측면에 모이도록 합니다. 이 과정은 약 20초 정도 소요됩니다. 모든 비즈가 잘 수집될 수 있도록 랙을 두 번 흔들어 줍니다.

그 다음, 샘플 간에 팁을 교체하며 피펫으로 상층액을 제거합니다. 이어서 비드를 세척해야 합니다. 이를 위해 각 튜브에 1 mL의 lyase buffer를 넣고 비드를 부드럽게 재현탁합니다.

이는 랙에서 마그네틱 스트립을 제거하고, 튜브가 꽂힌 상태로 랙을 10~20회 정도 또는 비드가 균일하게 재현탁될 때까지 뒤집어 수행할 수 있습니다. 그 후, 마그네틱 스트립을 다시 배치하여 비드를 수집합니다. 파이펫으로 상층액을 제거합니다.

이 세척 과정을 3~5회 더 반복하십시오. 세척 단계마다 팁을 교체해야 함을 유의하십시오. 다음으로, 앞서 설명한 것과 동일한 방법으로 IP one buffer 1 mL를 사용하여 비드를 4~6회 세척하십시오.

그다음 동일한 방식으로, IP two buffer 1 mL로 비드를 4~6회 세척합니다. 마지막으로, 다른 세척 과정과 마찬가지로 pH 8.0의 TE buffer 1 mL로 비드를 4~6회 세척합니다. 최종 세척 후 TE를 제거합니다.

이제 4°C에서 3000 RPM으로 3분 동안 원심분리하여 잔류 TE 버퍼를 제거합니다. 이제 비즈에서 크로마틴을 용출할 준비가 되었습니다. 먼저, 용출 버퍼 210 µL를 추가하고, 튜브를 65°C의 서멀 믹서에서 800 RPM으로 15분 동안, 또는 용출액의 회수율을 높이려면 최대 30분까지 배양하여 비즈로부터 물질을 용출시킵니다.

비드를 13,000 RPM에서 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액 200 µL를 제거하여 새 튜브로 옮긴 다음, TE buffer 200 µL를 첨가합니다. 이제 시료는 침전된 DNA의 가교를 해제하는 역가교(reverse crosslink) 단계를 진행할 준비가 되었습니다.

상층액을 65 °C 항온수조에서 최소 6시간에서 최대 15시간 동안 배양합니다. 응결 현상을 최소화하기 위해 항온수조에서 배양을 진행할 수 있습니다. 그다음, 50 µL의 입력 DNA 단계를 따릅니다.

용출물과 마찬가지로 65°C에서 배양하여 초음파 처리 후 역교차 길이를 가진 입력 DNA를 회수하였습니다. 이제 DNA를 정제할 준비가 되었습니다. 그 후 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전법을 사용하여 DNA를 정제하고 침전시킵니다.

침전된 DNA 펠릿을 물에 재현탁한 후 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 향후 사용을 위해, 정제된 입력 DNA를 아가로스 겔 전기영동하여 전단된 크로마틴의 크기를 확인할 수 있습니다. 이상적으로 염색체 조각은 250에서 750 bases 사이여야 합니다.

지금까지 인간 배아줄기세포를 이용한 크로마틴 면역침강법 수행 방법을 살펴보았습니다. 이 실험을 수행할 때는 고친화도 항체와 적절한 크기 범위의 크로마틴을 사용하고, 고엄격성 세척 단계를 거치는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.