Name: 우수한 Colliculus의 표면에 플루오로 - 골드의 응용 프로그램에 의해 망막 신경절 세포의 퇴보 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 학습하세요 쥐 망막 신경절 세포의 퇴행성 표지 기법으로, 상위 측두체에 플루오로-골드를 적용하여 시각 경로를 추적하고 약물 효과를 평가하는 방법입니다.

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저자는 미국의 건강 보조 재단 국립 녹내장 프로그램의 지원 감사드립니다.

<ol><li> 케타민 (80mg/kg)과 xylazine (8mg/kg) (2시 1분에서 볼륨 비율)의 내부 복막 주사로 쥐 마취시키다. 수술 중 각막의 건조 방지하기 위해 무균 눈 윤활유 연고를 적용합니다. </li><li> 머리 털이 (안구의 귀 수준)를 면도하고 앞니 표시줄에 해당 incisors을 클램프 및 설정 머리로 머리를 무대에서 머리를 수정. </li><li> 소독 작업 70 % 알콜 다음 10 % povidone의 요오드 솔루션 공간이 있습니다. </li><li> 피부와 두개골과 봉합 (화살, 코로나와 가로 봉합) (그림 1) 노출 근육을 잘라. 절개 영역으로 스플래시 (2 MG / kg을 초과하지 않는)과 같은 진통제, bupivicaine을 적용합니다. </li><li> 화살 봉합사의 양쪽에 두개골 구멍을 (ø 2x2 mm, 화살 및 가로 봉합 양쪽에서 0.5 ㎜) 드릴. meninges의 파열과 봉합 아래 누워있는 부비동을 피한다. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="살아있는 쥐 두개골에 특징." width="469" height="317" /> 그림 1. 살아있는 쥐 두개골에 특징. </li><li> 스프링 가위로 meninges를 열고 잘라 찢어하지 마십시오. </li><li> 진공 펌프와 세 체크 포인트를 볼 수 있습니다하여 조심스럽게 우수한 colliculus의 등의 표면을 통해 거짓 대뇌 내용을 대기음 : <ol><li> 회색으로 회색에서 흰색으로 뇌 조직 변경의 색상 </li><li> 무색 뇌척수가 올 때 aspirating 중지 </li><li> 조심스럽게 두라이 적용 노란 우수한 colliculus를 노출 수평 가장 낮은 흡입 수준 확대 </li></ol></li><li> SC 네 가지 가장자리 직접 현미경으로 관찰 할 수있을 때까지 SC 통해 두뇌 내용을 대기음. 삭제 대뇌 피질의 부분은 바람직하지 않은 부작용 (예, 모터 장애) 피하기 위해 최소화되어야합니다. 부비동 만지지 않도록주의하십시오. </li><li> 가능한 SC의 표면이 건조하기 위해 미세 무균 면화 줄무늬가있는 구멍에서 액체를 흡수. 그런 다음, 젤라틴 스펀지의 얇은 레이어를 장소 사전 절어 SC의 표면에 6 % 플루오로 - 골드 (FG가 망막 신경절 세포의 축삭 터미널 의해 촬영 및 양자 망막에서의 somas에 retrogradely 수송 임). </li><li> gelfoam로 입구를 기입하고 봉합 클립과 피부 상처를 닫습니다. </li><li> 동물 보온 백열 전구 아래에서 복구할 수있었습니다. 진통, buprenorphine (100mcg/kg)는, SC 라벨 후 5 일 동안 마시는 물 속에 구두 적용됩니다. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol><li> 왜 망막 신경절 세포 개수이 수술 방법을 사용합니까? 쥐의 망막 신경절에 세포의 98 % 정도는 (RGC) contralateral 우수한 colliculus (SC)에 프로젝트로 알려져있다. 우리가 녹내장이 가장 취약한 망막 신경 세포에 집중할 수 있도록 SC의 표면에 플루오로 - 금을 적용은 RGCs의 거의 모든 라벨 수 있습니다. 2 일 가로 시신경의 그루터기에서 FG를 넣어 RGC의 역행 라벨과 비교, RGC 생존의 간섭이 최소화됩니다. 망막 신경절 세포 레이어에있는 혈관의 얼룩은 amacrine 세포, RGC 및 endothelia 세포,이 방법은 RGC에보다 구체적인 것을 cresyl 보라색 얼룩과 비교합니다. </li><li> 과도한 출혈을 방지하려면 어떻게해야하나요? 첫째, 쥐의 근육 색조와 각막 반사를 확인하여 제대로 anaesthetized 있는지 확인하십시오. 부족 마취는 광범위한 출혈을 일으킬 것입니다. 둘째, 이러한 치료 너무 가까이 드릴링이나 부비동 벽에 meni...

우수한 colliculus의 표면에 플루오로 - 골드의 응용 프로그램에 의해 망막 신경절 세포의 퇴보 라벨링

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

망막 신경절 세포 (RGC) 집계 특히 녹내장에서 망막 변성을 평가하는 것이 필수적입니다. 신뢰성 RGC 라벨은 치료 효과를 평가하기 위해 필수적입니다. 쥐에서 RGCs의 98 % 정도는 contralateral 우수한 colliculus (SC) (포레스터와 피터스, 1967)에 프로젝트에 알려져 있습니다. 우리가 녹내장이 가장 취약한 망막 신경 세포에 집중할 수 있도록 SC의 표면에 플루오로 - 금 (FG)를 적용은 거의 모든 RGCs 레이블을하실 수 있습니다. FG는 망막 신경절 세포의 축삭 터미널 의해 촬영 및 양자 망막에서의 somas에 retrogradely 이송됩니다. 2 일 가로 시신경의 그루터기에서 FG를 넣어 RGC의 역행 라벨과 비교, RGC 생존의 간섭이 최소화됩니다. 얼룩의 RGCs, amacrine 세포와 망막 신경절 세포 레이어에있는 혈관의 내피,이 분류 방법은 RGC에보다 구체적인 것을 cresyl 보라색 얼룩과 비교합니다. 이 비디오는 SC의 표면에 적용하여 FG RGC의 역행 라벨링 방법을 설명합니다. SC을 폭로하는 피질을 aspirating와 SC의 전체 등의 표면 위에 젤라틴 스폰지를 적용 표시되며 수술 절차는 두개골을 천공 있습니다. SC의 대규모 intracranial 출혈과 뜻을 피하에 대한 유용한 팁을 제공하고 있습니다.

이 동영상은 우수한 colliculus (SC)의 표면에 플루오로 - 금 (FG)를 적용하여 RGC의 역행 라벨링 방법을 설명합니다. 기술은 두개골을 시추 피질을 aspirating와 SC의 전체 등의 표면 위에 젤라틴 스폰지를 적용 포함됩니다.

우수한 Colliculus의 표면에 플루오로 - 골드의 응용 프로그램에 의해 망막 신경절 세포의 퇴보 라벨링

망막 신경절 세포(RGC) 계수는 특히 녹내장에서의 망막 퇴행을 평가하는 데 필수적입니다. 신뢰할 수 있는 RGC 표지는 ...을 위한 기초가 됩니다.

안녕하세요, 홍콩 대학교 GOSO Lab의 Tu입니다. 오늘은 쥐의 망막 신경절 세포를 레트로그레이드 방식으로 표지하는 방법을 소개해 드리겠습니다.망막 신경절 세포는 상구 표면에 형광 염료를 도포하여 역행성으로 표지하게 되며, 이를 통해 나중에 평평하게 준비된 망막에서 망막 신경절 세포의 수를 세어 세포 사멸이나 투여된 약물의 효과를 평가할 수 있습니다. 이 사진은 망막에서 상구로 이어지는 경로를 보여줍니다. 형광 염료는 시신경로를 통해 상구에서 역행성으로 운반될 수 있습니다.시신경을 통해 안구의 망막까지 optic chama를 통과시킵니다. 수술을 위해 수술용 현미경을 사용합니다. 뇌 피질을 흡인하기 위해 펌프를 사용하며, red hat을 제자리에 고정하기 위해 CLE 헤드 스테이지를 사용합니다.학교(교정)를 개방하기 위한 rat 드릴과 클릭리스 표면에 형광 염료 FG를 도포하기 위한 흡수성 젤 패드를 준비합니다. 미세 핀셋, 스프링 가위, 진공 바늘, 드릴 팁 및 봉합 클립을 포함한 기구들은 수술 전 오토클레이브로 멸균하였습니다. 피부 절개를 위한 수술용 칼, 측정을 위한 자, 그리고 솜 또한 멸균된 상태로 준비합니다.우리는 케타민과 자일라진의 복강 내 투여를 통해 쥐를 마취했습니다. 눈 높이에서 귀 높이까지 복부를 제모한 후, 포비돈 요오드와 70% 알코올로 수술 부위를 소독했습니다. 그런 다음 쥐의 머리를 헤드 스테이지 위에 고정했습니다.눈 높이부터 귀 높이까지 머리의 중앙선을 따라 피부를 절개합니다. 그러면 관상봉합(chrono suture), 시상봉합(sagittal suture), 전사봉합(transport suture)이 잘 노출되며, 여기는 BMA이고 여기는 람다(Lambda)입니다. 전사봉합의 AL 끝단에서 0.5~1mm 떨어진 지점에 나사 위치를 표시한 다음, 양측에 대칭적으로 표시하여 표시 지점이 봉합선에서 최소 0.5mm 떨어져 있는지 다시 한번 확인합니다.그 다음 마커 표시를 따라 구멍을 뚫기 시작하며, 드릴의 속도와 방향을 조절하여 봉합선 아래의 뇌수막과 부비동 내벽이 넓게 파열되도록 합니다. 구멍의 직경이 약 2mm가 되면 드릴질을 멈춥니다. 그런 다음 다시 반대편 거울을 통해 구멍의 크기와 위치가 적절한지 확인합니다.스프링 가위로 뇌수막을 절개합니다. 미세 핀셋을 사용하여 구멍 내의 골 파편을 제거합니다. 이제 진공 펌프를 사용하여 흡인을 시작할 수 있습니다. BR의 첫 번째 층은 뇌수막과 함께 절개된 녹색 물질입니다.그러면 tcell 색상이 흰색으로 변하는 것을 볼 수 있습니다. 이것이 바로 척수의 백질입니다. 흡입을 천천히 주의해서 수행하십시오.이제 회백질을 다시 확인할 수 있습니다. 색상이 덜 하얗게 변하고 있습니다. 하단 부분이 회색인 것을 볼 수 있습니다.알겠습니다. 여기서 맑은 뇌척수액(CSF)이 나오는 것을 볼 수 있습니다. 이는 우리가 상부 뇌량의 등쪽 표면에 도달했음을 의미합니다.이 단계에서 다시 구멍을 확장합니다. 그러면 바닥 부분에서 상경막(superior clus)을 덮고 있는 황색의 경막을 확인할 수 있습니다. 상경막의 내용물이 손상되는 것을 방지하기 위해 이 레벨에서 수평 흡입을 수행합니다.이제 전체적으로 시작할 수 있습니다. 초록색 물질이 보이실 겁니다. 실제로 초록색을 띱니다.그런 다음 백질을 살펴보겠습니다. 조직의 색상은 흰색입니다. 이제 뇌척수액(CSF)이 회색 부위 아래로 아주 매끄럽게 흐르는 것을 볼 수 있습니다.회색질의 마지막 층을 제거하면 노란색의 경막이 노출됩니다. 이제 개별 클릭커 위의 경막을 조심스럽게 절개한 후 구멍을 넓힙니다. 현미경으로 클릭커의 전체 가장자리를 관찰할 수 있도록 주의하십시오.헤드 스테이지의 헤드 클램프를 다양한 각도로 조절하고, 현미경 하에서 CLE의 네 모서리가 직접 관찰될 때까지 최종 흡인을 수행합니다. 가는 면 솜 조각으로 구멍 속의 액체를 흡수하여 CLE 표면을 최대한 견고하게 만듭니다. 6% fuel gold로 사전 도금된 젤라틴 조각을 준비하여 이를 작은 조각들로 분리합니다.얇은 층으로 만들며, 크기는 상단 전체 배면보다 약간 더 크게 합니다. 상단 클릭커 표면에 조심스럽게 올린 다음, 반대편에도 올립니다. 구멍 내부의 전체 표면을 덮도록 배치하여 분사량이 더 많은 구멍을 통해 처리합니다.마지막으로, 봉합 클립으로 피부 상처를 닫고 수술 후 상처 부위를 세척한 뒤, 쥐를 깨끗한 케이지에 넣고 따뜻한 환경에서 회복하도록 합니다. 쥐는 깨어난 후 수술 후 정상적인 행동을 보입니다.SC 라벨링 7일 후, 망막을 적출하여 평평하게 마운트한 다음, UV 필터가 장착된 현미경을 사용하여 망막 신경절 세포의 수를 측정합니다. 망막 신경절 세포의 98%가 상구로 투사되므로, 신뢰할 수 있는 ST 라벨링은 질병의 진행 및 약물 효과를 평가하는 데 필수적입니다. 이는 평평하게 마운트된 망막에서 역행성 라벨링된 망막 신경절 세포의 예시입니다.

retrograde-labeling-retinal-ganglion-cells-application-fluoro-gold-on

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 망막 신경절 세포의 90 퍼센트 (RGCs)은 누구의 axons 완전히 axotomy 후 14 일 이내에 죽는 (axotomy) 그었 있습니​​다. 이 모델은 실험 조작을 쉽게받을 수있는 고도 재현할 수 있습니다.

시신경의 절개 : 중추 신경계에서 신경 세포의 Apoptosis 성인의 모델

시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 이 모델은 전 세계적으로 망막을 대상에 직접 망막 신경절 세포의 부상의 연결 인구를 대상으로 실험 조작의 번호를 수행하는 데 이상적입니다.

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

형광 염료의 역행 전송 해부학 적 투사에 따라 신경 세포의 하위 인구 레이블. 레이블 축삭은 시각적 대상이 될 수...

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

출처: Inal, M. A. et. al., Retrograde tracing of Drosophila Embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes(유성필 형광 염료를 사용한 {{}}초파리{{}} 배아 운동 뉴런의 역행 추적. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 친유성 염료를 사용하여 Drosophila 운동 뉴런의 역행 표지 방법을 보여줍니다. 염료는 축삭돌기로 들어가 역행적으로 이동하고 뉴런을 녹색으로 표시하여 컨포칼 현미경 하에서 뉴런의 형태와 투영을 자세히 시각화할 수 있습니다.

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes (형광 친유성 염료를 사용한 초파리 운동 뉴런의 역행 라벨링)

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

우리는 성체 제브라피쉬에서 망막 신경절 세포(RGC)를 역행하는 효율적인 방법을 소개합니다.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

postembedding immunogold 방법은 특정 분자의 세포 내 국소화에 대한 고해상도 분석을 제공하는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다. 여기에서는 망막 리본 시냅스에서 글루타메이트 수용체를 정량적으로 분석하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

망막 신경 절 세포 (RGCs)의 2 차 변성 녹 내장에서 일반적으로 발생합니다. 이 연구 부분 시 신경 transection 위한 혁신적인 수술 접근 방법을 설명합니다. 이 공간 절약 요원 접근의 사용 모델의 응용 범위를 확장 하며 보조 부상 메커니즘의 탐사 RGCs에 새로운...

쥐에 있는 부분 시 신경 Transection: 망막 신경 절 세포의 2 차 변성을 평가 하기 위해 새로운 수술 방식으로 설립 모델

학습하세요 쥐 망막 신경절 세포의 퇴행성 표지 기법으로, 상위 측두체에 플루오로-골드를 적용하여 시각 경로를 추적하고 약물 효과를 평가하는 방법입니다.

우수한 Colliculus의 표면에 플루오로 - 골드의 응용 프로그램에 의해 망막 신경절 세포의 퇴보 라벨링

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