쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

안녕하세요, 저는 터프츠 대학교 의과대학 약리학 및 실험 치료학과의 Emmanuel Pothos 연구실 소속 Lauren Frank입니다. 그리고 저는 Emmanuel Pothos입니다. 오늘은 설치류 신생아로부터 일차 중뇌 도파민 세포 배양물을 생성하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 절차는 도구 및 시약 준비, P0에서 P2 단계의 설치류 뇌 중뇌 박리, 뇌 분절의 분쇄 및 해리된 뉴런의 플레이팅 단계를 포함합니다. 이제 시작하겠습니다.

이 절차에는 도파민 뉴런 배양을 시작하기 2~3주 전에 미리 수행해야 하는 여러 준비 단계가 있으며, 글리아 세포가 증식하여 디쉬 바닥을 덮을 수 있도록 미리 플레이팅해야 합니다. 1차 뉴런 세포 배양의 1~7일 전에 글리아 세포 단층 위에 1차 도파민 뉴런을 배양합니다. AC 배양 전날, 글리아 세포의 배지를 제거하고 2 mL의 신선한 뉴런 배지로 교체합니다. 12개의 박리 플레이트를 포함하여 박리 도구를 제외한 모든 품목은 UV 광선을 사용하여 멸균해야 합니다.

마이크로 마그네틱 교반 바가 포함된 해리용 바이알 2개. 상단에 작은 구멍이 2개 뚫린 바이알 캡 2개. 펼쳐 놓은 슬라이드 링들.

그리고 슬라이드 링 박스는 열어두는 것을 잊지 마십시오. 배양 당일 시작 전, 이 모든 도구들은 70% ethanol로 코팅됩니다. 먼저, 일차 신경세포 용액을 해리하는 데 사용될 pepane 용액의 모든 성분을 냉동고에서 꺼내어 해동시키십시오.

가열판을 설정하여 비커의 물을 34 °C로 가열해 소화 과정을 준비하고, 페판 용액의 산소 공급을 위해 카보겐 포화수를 준비합니다. 소화 과정 중에, 해부 전 뇌 세척을 위해 4~6 mL의 멸균 PBS가 담긴 멸균 튜브 15개를 준비하여 얼음에 둡니다. 20~30 mL의 신선한 신경세포 배지를 할당하여 배양기에 넣습니다.

다음으로, 멸균 플립 여과 장치를 사용하여 페파네(pepane) 용액을 여과하고, 이를 25 mL 해리 바이알로 옮겨 해리 바이알을 준비합니다. 바이알에 멸균 시린지를 삽입하고 캡에 구멍을 낸 뒤, 0.2 µm 필터를 연결합니다. 필터에 카보젠(carbogen)을 연결하고 파라필름으로 고정합니다. 바이알을 스티로폼 디스크에 놓습니다.

해리 바이알을 배치한 후, 마그네틱 스터 바가 움직이고 있는지 확인하십시오. 가스가 바이알 내부로 유입되고 있으며, 온도는 34 °C로 안정화되었습니다. 해부 현미경을 후드 안으로 가져오고 해부 도구들을 알루미늄 호일 위에 정렬합니다.

그 다음, 큰 알루미늄 호일 한 장과 작은 정사각형 호일 12장을 준비합니다. 호일을 이용한 머리 제거(decapitation)를 위해 가위를 함께 둡니다. 후드 외부에 얼음물이 담긴 스티로폼 박스를 배치합니다.

다음으로, ketamine 0.075 milliliter와 xylazine 0.075 milliliter의 혼합물인 마취제를 준비합니다. 그런 다음 23 millimeter 유리 웰이 있는 135 millimeter 플레이트용으로 P0에서 P2 단계의 새끼 쥐를 최소 12마리 확보하십시오. 마우스의 경우, 전체 한 배의 새끼들이 유전형이 일치하는지 확인하십시오.

유전형을 알 수 없는 경우, 각 동물의 세포를 별도의 디시에 플레이팅해야 하며, 이후 유전형 분석 결과와 세포를 대조할 수 있도록 정확한 기록을 유지해야 합니다. 해부를 시작하려면 ketamine Xylazine을 복강 내 주사하여 첫 번째 동물을 마취하십시오. 꼬리 반사 테스트(tail flick test)에 동물이 반응하지 않으면, 저체온 상태가 될 때까지 30초 동안 얼음물에 넣으십시오.

그 다음 70% ethanol로 소형 알루미늄 호일 조각, 안락사 가위 및 동물의 머리를 헹구어 박리 과정 중 뇌 조직의 오염을 방지합니다. 가위로 머리를 절단하여 알루미늄 호일 조각 위로 떨어뜨린 후 후드 안으로 옮깁니다. 소형 가위로 피부를 절개하여 두개골을 노출시킨 후 조심스럽게 뇌를 제거합니다. 두개골 주변을 360도 방향으로 절개합니다.

그런 다음 핀셋으로 두개골 캡을 벗겨냅니다. 작은 스패튤라를 사용하여 뇌를 두개골에서 들어내어 ice가 담긴 15 milliliter 튜브에 넣습니다. Cold PBS 튜브를 다시 ice 위에 올려두고 다음 S 뇌를 적출합니다.

별도의 튜브에 담긴 뇌 3개가 얼음 위에 준비될 때까지 해부를 반복합니다. 뇌 하나와 PBS를 첫 번째 해부 접시에 붓습니다. 현미경 하에서, 칼날의 예리함이 유지될 수 있도록 뇌를 실 가드 글루(sill guard glue) 플랫폼 위에 쿠션처럼 배치합니다.

전이 피펫을 사용하여 분절들을 깨끗한 PBS 튜브에 넣고, 파파인 용액으로 옮기기 전에 분절들을 세척합니다. 첫 번째 분절이 들어갈 때 타이머를 시작하고, 모든 뇌가 파파인에 의해 소화될 때까지 해부를 계속합니다.

첫 번째 뇌 분절들은 약 1시간 동안 소화되었을 것입니다. 마지막 분절들을 추가할 때까지 소화 과정이 1시간 더 진행되도록 하십시오. 페파네 배스(pepane bath)의 온도가 34 °C에서 안정적으로 유지되고 있는지 확인하십시오.

침전 단계를 시작하려면 전이 피펫을 사용하여 뇌 절편을 멸균된 15 milliliter 튜브에 넣습니다. 과도한 pepane 용액이 함께 들어가지 않도록 주의하십시오. 만약 용액이 과하게 들어갔다면, 과잉된 pepane을 제거하십시오.

다음으로, 인큐베이터에서 꺼낸 따뜻한 신경세포 배지 2 mL를 첨가하여 절편들을 세척합니다. 절편들이 가라앉을 때까지 기다린 후, 절편들이 흐트러지지 않도록 주의하며 용액을 최대한 제거합니다. 이 세척 과정을 총 3회 반복합니다.

교차 오염을 방지하기 위해 세척 단계마다 새로운 피펫 팁으로 교체하십시오. 2 mL의 뉴런 배지에서 반복 작업을 시작합니다. 공기 방울이 생기지 않도록 주의하며 25회 트리튜레이션(trituration)하십시오.

그 후 결합되지 않은 분절들이 3분 동안 가라앉도록 둡니다. 전이 피펫을 사용하여 바닥의 분절들을 건드리지 않고 가능한 한 많은 상층액을 수집합니다. 수집한 상층액은 새로운 멸균 15 milliliter 튜브에 보관합니다.

1000 µL 피펫 팁과 이어서 200 µL 팁을 사용하여 이전 단계를 반복하며, 이후 분절들이 육안으로 보기에 완전히 해리되어야 합니다. 모든 처리 과정에서 발생한 상청액은 동일한 15 mL 튜브에 수집합니다. 이제 세포를 플레이팅할 준비가 되었습니다. 세포 수를 측정하기 위해 전이 피펫으로 최종적으로 10회 반복 혼합하여 균질한 세포 현탁액을 만듭니다.

멸균된 노란색 피펫 팁으로 핀셋의 각 끝부분을 덮습니다. 슬라이드 링을 유리판의 중앙에 최대한 맞춰 조심스럽게 떨어뜨립니다. 각 디쉬 내에서 이 링들은 배양 디쉬 내에서 뉴런이 플레이팅될 영역을 격리하는 데 사용됩니다.

피펫 팁을 사용하여 각 디쉬의 중앙 웰 위에 링을 미끄러지듯 배치하십시오. 그런 다음 적절한 부피의 세포를 디쉬에 조심스럽게 첨가하십시오. 세포는 디쉬에 미리 배치한 링의 중앙에 첨가합니다.

각 디쉬마다 팁을 교체해야 함을 기억하십시오. 다음으로, 뉴런의 증식을 돕기 위해 각 디쉬의 링 외곽에 최대한 가깝게 희석된 GDNF 용액 100 µL를 첨가합니다. 그다음, 글리아 세포의 과증식을 방지하기 위해 유사분열 억제제인 fluoro dioxine 또는 FDU를 링 외곽에 첨가합니다.

피펫 팁을 다시 끼운 후 배양기에 넣고 세포가 하룻밤 동안 가라앉도록 둡니다. 다음 날 멸균 피펫 팁으로 핀셋 끝을 감싸 링을 제거한 뒤, 접시를 배양기에 다시 넣고 실험 전까지 최대한 건드리지 않도록 합니다. 매일 접시의 오염 여부를 확인하고, 오염이 관찰되면 해당 접시를 즉시 제거합니다. 배양된 세포는 3주 이내에 전기생리학, 분자생물학 실험 및 면역세포화학 분석에 사용할 수 있습니다.

세포 배양이 완료되었으므로, 배양 중인 세포의 대표적인 예시들을 살펴보겠습니다. 여기서는 14일 전에 분주한 일차 배양 세포를 보고 있습니다. 돌기들이 뻗어 나온 뚜렷한 세포체가 관찰되므로, 이는 양호한 배양 사례에 해당합니다.

또한, 감염을 나타내는 곰팡이나 균류의 성장이 접시에 없는지 확인하십시오. 지금까지 설치류 신생아로부터 일차 해리 중뇌 도파민 세포 배양물을 생성하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때 멸균 환경을 유지하고, P0에서 P2 단계의 신생아만을 사용하며, 글리아 조건 배지가 포함된 건강한 글리아 기질 위에 도말하고, 일정한 도말 밀도를 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.