Name: Matrigel에 MEFs에서 분리 hESCs : MEFs에서 Matrigel 2 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-09T18:48:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 배우세요 MEFs에서 Matrigel로 hESCs를 분리하고 배양하는 방법을. 면역형광 현미경으로 다능성을 확인하는 이 기술은 재생의학 연구에 필수적인 무사육자 조건에서 줄기세포를 유지하는 표준화된 프로토콜을 제공합니다.

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Teitell 연구실에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 UCLA, 특히 박사 Amander 클라크 박사 제롬 잭, 우리의 연구들의 지원 UCLA 브로드 연구소 줄기 세포 핵심 시설의 멤버에 재생 의료 및 줄기 세포 연구의 브로드 센터의 회원을 감사드립니다.

hESC 문화 일상 유지 보수 <ol><li> hESC 문화 미디어는 모든 24 시간을 변경해야합니다. 4 ° C에 저장된 ES 미디어 주식 병에서 (6 잘 플레이트 당 ~ 20ml) 필요한 솔루션의 금액, 50ml 팰컨 관에서 개최하고, ° C 물 목욕 37에 따뜻한를 꺼내. 미디어가 따뜻하게되면 10ng/ml의 최종 농도가 4에 저장된 bFGF ° C를 추가합니다. ° C 즉시 사용 후 4 다시 bFGF 주식을 버려! </li><li> 모든 6 자 접시에서 제거하지만, 미디어의 500μl를 ~. 소용돌이 제거 파편을 일시 중 지할 수있는 문화 접시를해야합니다. hESC 문화 미디어에서 bFGF가 철저하게 혼합되어 있는지 확인하고 6 자 판의 각 잘 돌아 신선한 미디어 3ml를 추가합니다. 인큐베이터에있는 플레이트 다시 꽂아. </li></ol> Matrigel에 MEFs에서 분리 hESCs 보통 MEFs에 hESCs의 합류 6 자 판은 6 - 잘 접시는 우물이 4-5일 분리 후 다시 합류되고 함께 Matrigel에 1시 3분부터 1시 2분까지을 분할 수 있습니다. <ol><li> Matrigel, MEF - 냉방 미디어 (CM)에 분할 hESCs는 pluripotency 유지하는 데 사용됩니다 때. MEF - 냉방 미디어가 사전에 이루어집니다. 첫날, 1.5 × 10 7 γ - 반구 MEFs는 T75 플라스크에 씨앗을 품고 있습니다. 두 번째 날에는 MEFs는 실온 1 × PBS, pH를 7.4로 한 번 씻어하고 있으며, 다음 5ng/ml bFGF와 보충 ES 미디어의 15ml는 술병에 추가됩니다. (참고 : MEFs가 작은 또는 큰 flasks로 도금 수 있지만 세포 밀도와 ES 미디어의 볼륨 간의 비율이 일정해야합니다.) 플라스크가 다른 24 시간을위한 37 ° C에서 incubated입니다. 셋째 날, CM은 5ng/ml bFGF와 보충 신선한 ES 미디어 15ml로 수집 및 교체됩니다. 수집된 CM은 4 ° C.에 저장됩니다 MEFs 중 하나 도금에서 MEF - 냉방 미디어 15 × 7 = 105ml를 생성하기 위해 7 연패 일 동안 수확하고 있습니다. 7 일 후에 모든 CM의 분수가 결합되어, 살균, 여과 aliquoted 및 -20 ° C.에 저장된 저장하고 1 달 동안 사용할 수 설명된 CM 미디어가 준비했습니다. </li><li> hESC 분리하기 전에 어느 날, ° C는 하루 해동 4에서 eppendorf 튜브에 Matrigel의 aliquots 넣어 (한 나누어지는가 Matrigel의 76.2mg가 포함되어 있으며,이 하나의 6 - 플레이트 잘에 필요한 금액입니다.) 분할의 날, 한 6 자 접시 해동 Matrigel 중 하나 약병을 얼음에 차가운 DMEM/F12 미디어의 병을과 6ml를 넣어. DMEM/F12 미디어에 Matrigel을 전송하고 잘 섞는다. 6 잘 접시의 각각 잘 수있는 솔루션의 1ml을 추가합니다. 소용돌이 플레이트 표면에 Matrigel을 배포하고 분할 hESCs 전에 적어도 1 시간을 위해 실내 온도에서 Matrigel - 커버 플레이트를 부화. </li><li> MEFs에 hESCs는 1 × PBS, pH를 7.4로 한번 세탁하고 있습니다. 따뜻한 collagenase IV (1mg/ml)의 이후 1ml는 6 잘 플레이트의 각 잘에 추가되고 다음 판은 37 incubated 수 있습니다 ° C를 50-10 분. </li><li> 각 잘하는 bFGF없이 ES 미디어의 1ml을 추가합니다. 접시에서 줄기 세포를 날려 버릴 1ml 피펫을 사용합니다. 50ml 매는 튜브로 hESCs과 죽은 MEFs의 대단히 짧은 시간을 포함하는 모든 미디어를 수집합니다. MEFs가 뜨는에 정지 상태 동안 hESC의 대단히 짧은 시간이 튜브 하단의 펠렛을 형성 있도록 세포의 먼지 입자들이 큰 덩어리 5-10 분 정착하자. 뜨는을 취소하고, 5 분 200g에 실온에서 원심 분리 다음 bFGF을 부족한 ES 미디어를 사용하여 hESC 펠렛을 resuspending로 씻으십시오. </li><li> 판 Matrigel 접시에있는 줄기 세포를하려면 먼저 실온 DMEM/F12 (물론 당 1ml)과 잘 따라 10ng/ml bFGF와 보충 CM의 2.5ml을 추가로 Matrigel 접시를 씻으십시오. 대단히 짧은 시간이 균일하고 크기가 작은이 될 때까지 10ng/ml bFGF, 피펫 세포 현탁액 위아래로 몇 시간을 보충 CM의 적절한 볼륨으로 펠렛을 Resuspend. Matrigel 접시 잘 당 0.5ml로 나누어지는 정지합니다. Matrigel에 식민지 밀도가 MEFs에 대한 일반적인 분할하여 식민지의 밀도보다 높은됩니다. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> Matrigel에 hESCs을 유지하려면, 10ng/ml bFGF와 함께 보충 CM 미디어는 최대 4-5일하는 모든 24 시간을 변경합니다. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts++%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

이 동영상은 어떻게 통과 hESCs에 MEF 플레이트에서 피더 셀 - 무료 Matrigel 번호판을 보여줍니다. Matrigel에 식민지 밀도가 MEFs에 대한 일반적인 분할하여 식민지의 밀도보다 높은됩니다. 그러한 월 4 SSEA - 4로 hESC pluripotency 마커에 대한 Immunofluorescence 염색법과 현미경이나 흐름 cytometry는 피더 무료 문화 조건에 undifferentiated 상태에서 hESCs의 유지를 확인하기 위해 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> 비필수 아미노산 (Non-essential Amino Acids)</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>시약</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>시약</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>시약</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin </td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>시약</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 항체</td><td>시약</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;rythrin Conjugated Mouse IgG3</td><td>시약</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITCI-conjugated antirabbit IgG</td><td>시약</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

matrigel에 mefs에서 분리 hescs : mefs에서 matrigel 2

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

이 동영상은 어떻게 MEF 플레이트에서 통과 hESCs에 피더 셀 - 무료 Matrigel 플레이트에 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다.

이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 2.

Matrigel에 MEFs에서 분리 hESCs : MEFs에서 Matrigel 2

이 영상에서는 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 피더 세포 상에서 인간 배아 줄기세포(hESC)를 배양하는 방법과 MEF에서 hESC를 계대 배양하는 방법을 시연합니다.

인간 배아줄기세포 배양을 유지하려면 24시간마다 배양액을 교체해야 합니다. 이를 위해 4°C에 보관된 배아줄기세포 배지 스톡 병을 준비합니다. 보통 6웰당 약 20 mL 정도의 필요한 용액 양을 덜어냅니다.웰 플레이트에서 해당 양을 취해 50 milliliter Falcon 튜브에 넣고, 튜브와 내용물을 항온 수조에서 37 degrees Celsius로 가온합니다. 배지가 가온되면, 4 degrees Celsius에 보관해 두었던 FGF를 최종 농도가 10 nanograms per mil이 되도록 첨가합니다. 사용 직후 BFGF 스톡을 즉시 4 degrees Celsius로 다시 옮겨 보관해야 함을 잊지 마십시오.인간 amox 줄기세포 배양 배지 내의 BFGF가 충분히 혼합되었는지 확인하십시오. 다음으로, 각 웰에서 배지를 모두 제거하되 웰당 약 500 µL만 남깁니다. 그 후, 6-웰 플레이트의 각 웰에 신선한 배지 3 mL를 다시 넣고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣으십시오.인간 배아줄기세포를 ONM에서 유지 관리하는 방법을 살펴보았으므로, 다음으로는 이들을 Matrigel로 전이하는 방법을 보여드리겠습니다. ONM에서 배양된 인간 배아줄기세포를 Matrigel로 분할하기 위해, 우선 MES 상에서 세포가 가득 찬(confluent) 6-웰 플레이트를 준비하며, 이를 Matrigel이 코팅된 6-웰 플레이트에 1:2 또는 1:3 비율로 분할하여 접종할 수 있습니다.이렇게 하면 세포 분할 후 4~5일이 지나면 웰(well)의 세포들이 다시 합쳐져 합세(confluent) 상태가 됩니다. 인간 배아줄기세포를 마트리겔(matrigel)에 분할하여 배양할 때는 다능성을 유지하기 위해 meth 조건 배지를 사용하며, meth 조건 배지는 사전에 제작합니다. 이는 성장 중인 meth 배양액에서 5 ng/mL의 BFGF가 첨가된 배지를 7일 동안 매일 수집하여 준비하며, 제거된 meth 조건 배지 대신 배아줄기세포 배지를 사용합니다.매일 수행합니다. Meth 조건화 배지는 수집 후 냉동 보관한 시점부터 최대 한 달까지 사용해야 합니다. 인간 배아줄기세포 분할 전날, EOR 튜브에 담긴 Matrigel 분주액을 -20 °C에서 4 °C로 옮겨 하룻밤 동안 해동합니다.분주액 1개에는 6-웰 플레이트 1개에 필요한 양인 2 mg의 matri gel이 포함되어 있습니다. 세포 분할 당일, 해동된 matri gel 바이알 1개를 준비하십시오.각각의 6-웰 플레이트에 대해, 각 바이알을 6 mL의 차가운 D-M-E-M-F 12 배지와 혼합하십시오. 이때 반드시 얼음 위에 보관해야 합니다. 이 용액 1 mL를 6-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하십시오.그 다음, 플레이트를 회전시켜 표면에 Matrigel을 고르게 분산시킨 후, 인간 배아 줄기 세포를 분할하기 전까지 Matrigel이 도포된 플레이트를 상온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 인간 배아 줄기 세포를 분할하기 전, MES 상의 줄기 세포를 1X PBS pH 7.4로 한 번 세척합니다. 다음으로, 분할할 각 웰에 1 mg/mL 농도의 따뜻한 collagenase IV 1 mL를 첨가하고, 플레이트를 37 °C에서 5~10분 동안 배양합니다.배양 후, bFGF가 포함되지 않은 배아 줄기세포 배지 1 mL를 각 웰에 추가합니다. 1 mL 피펫을 사용하여 플레이트에서 줄기세포를 불어내어 분리합니다. 줄기세포 덩어리와 사멸한 MES가 포함된 모든 배지를 15 mL falcon 튜브에 수집합니다. 세포의 큰 덩어리들이 5분 동안 가라앉도록 두어, 줄기세포 덩어리는 튜브 바닥에 펠렛을 형성하고 MES는 상층액에 부유 상태로 남아 있게 합니다.세포가 충분히 가라앉은 것처럼 보이면, 상층액을 버리고 배아줄기세포 펠렛을 다시 현탁하여 세포를 세척합니다. BFGF가 포함되지 않은 배아줄기세포 배지를 사용하여 실온에서 200 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 원심분리하는 동안, 웰당 1 mL의 실온 D-M-E-M-F 12로 플레이트를 세척하고, 10 ng/mL가 보충된 조건화 배지 2.5 mL를 첨가하여 줄기세포 플레이팅을 위한 매트리젤 플레이트를 준비할 수 있습니다.원심분리 후 웰당 BFGF를 처리합니다. 10 ng/mL의 BFGF가 보충된 적절한 부피의 meth 조건 배지에 펠렛을 재현탁하고, 세포 덩어리가 균일하고 작아질 때까지 세포 현탁액을 여러 번 파이펫팅합니다.다음으로, 최종 부피가 웰당 3 mL가 되도록 매트리젤 플레이트의 각 웰에 현탁액을 0.5 mL씩 분주합니다. 매트리젤의 경우, 세포를 추가한 후 일반적인 플레이트 분할 시보다 더 높은 콜로니 밀도를 사용합니다. 플레이트를 37 °C 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.Matrigel 조건에서 인간 배아줄기세포를 유지하기 위해, 10 ng/mL BFGF가 첨가된 배지를 4~5일 동안 24시간마다 교체합니다.인간 배아줄기세포는 일반적으로 matrigel 상에서의 첫 번째 계대 배양 후 소량의 MEF가 혼입되어 있으나, matrigel에서 Matrigel로 진행하는 두 번째 계대 배양을 통해 줄기세포 배양물을 오염시키는 피더 세포의 흔적을 완전히 제거할 수 있습니다.

from-mefs-to-matrigel-2-splitting-hescs-from-mefs-onto-matrigel

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연구

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Biology

생물학

이 비디오에서 우리는 우리의 실험실은 정기적으로 트립신과 색채 인간 배아 줄기 세포 라인을 통로 방법을 보여줍니다.

트립신과 Passaging 색채 인간의 배아 줄기 세포 - 라인

이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다. 3 부 1.

MEFs부터를 Matrigel하기 : MEFs의 면전에서 Passaging hESCs를

이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 3.

MEFs에서 Matrigel 3 : Matrigel에 Matrigel에서 Passaging hESCs

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

전환 문화에 피더 - 무료 조건에 지속적인 노력에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 유도와 문화 마우스 배아 피더 (MEFs)와 공동 문화에 달려 남아 있습니다. 여기, 우리는 신속하게 이전 실험에 hESC 문화에서 피더를 제거 소설 방법을 보여줍니다.

고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

여기에서는 해리된 단일 세포의 비집락형 단층(NCM) 성장을 기반으로 하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배양 프로토콜을 제시합니다. Rho 관련 키나아제 억제제 또는 라미닌 동형(laminin isoform 521, LN-521)을 활용하는 이 새로운 방법은 다량의 동질적인 hPSC 생산, 유전자 조작 및 약물 발견에 적합합니다.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

리포터 세포주 시각화 추적 이종 집단의 관심의 세포를 분리 할 수​​있는 수단을 제공한다. 그러나, 유전자 - 표적 인간 배아 줄기 세포에서 종래의 상동 재조합을 사용하여 매우 비효율적이다. 여기서, 우리는 아연 핑거 클레아 향상된 상동 재조합을 사용하여 EGFP CNS 중뇌 특정 전사 인자 PITX3 궤적 타겟팅 기술한다.

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

배우세요 MEFs에서 Matrigel로 hESCs를 분리하고 배양하는 방법을. 면역형광 현미경으로 다능성을 확인하는 이 기술은 재생의학 연구에 필수적인 무사육자 조건에서 줄기세포를 유지하는 표준화된 프로토콜을 제공합니다.

Matrigel에 MEFs에서 분리 hESCs : MEFs에서 Matrigel 2

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