Name: 잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 C. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-18T23:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 C. elegans를 활용한 도파민 신경 세포 변성 분석 방법으로 파킨슨병 유전자를 검증하는 기술입니다. 유전자 스크리닝을 통해 신경 보호 요인을 식별할 수 있습니다.

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우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 연구실에 운동 장애 연구는 바흐만 - 스트라우스 Dystonia &amp; 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨 질병 협회, 앨라배마 파킨슨병 협회, 파킨슨병 연구에 대한 마이클 J. 폭스 재단과 대학 연​​구소에 의해 지원되었습니다

A. 식 플라스미드 건설 두 plasmids이 필요합니다 : 조직 특정 관심의 유전자의 표현과 선택 전환 표시로 두 번째 (플라스미드 마커가 연구 공동체에서 일반적으로 사용할 수 있습니다하지만) 한. 실험 플라스미드 <ol><li> 관심 조직 / 세포 유형에 표현되는 모터를 선택,이 경우, 검사의 수송은 (Pdat - 1) 발기인이 사용됩니다. 이 표현 플라스미드는 복제 recombinational 1 모터 관심 하류의 유전자의 삽입을 허용하는 Invitrogen 게이트웨이 시스템을 호환 대상 벡터 (pDEST - DAT - 1)로 만들어졌습니다. </li><li> 관심 유전자의 cDNA는 PCR이 게이트웨이 AT &amp; T B recombinational 시퀀스를 포함하는 primers를 사용하여 증폭됩니다. 증폭된 cDNA 먼저 입력 벡터를 만들 수있는 기증자 벡터 pDONR201에 recombined 후 E. 대장균 DH5α 변형으로 변환됩니다. 성공 recombinants과 DNA의 미니 준비 고립의 선택에 따라, 입력 벡터는 표현식이 플라스미드 만들 pDEST - DAT - 1 대상 벡터에 recombined입니다. recombinational 복제에 대한 자세한 내용은 Invitrogen 게이트웨이 설명서 중 또는 콜드웰 외에서 사용할 수 있습니다. 5. </li></ol> 플라스미드 선택 마커 플라스미드 형질 마커는 명확한 조직에서 형광 단백질의 표현을 구동 모터와 벡터로 구성되어 있습니다. 이되도록 특정 프로 시저에서, UNC - 54 발기인은 신체 벽 근육의 벚꽃 단백질 발현 (: 벚꽃 Punc - 54)을시킵니다. Microinjection 통해 트렌스 제닉 C. 엘레간스의 B. 생성 관련 조브 문서를 참조하십시오 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833">https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833을</a> C. 유전자는 DA의 neurodegeneration 분석을위한 십자가 <ol><li> 웜 표준 절차 6을 사용하여 재배하고 있습니다. </li><li> 플레이스 10 Pdat - 1 : α - SYN, Pdat - 1 : 3-4 L4 단계 형질 전환 나온것과 짝짓기 접시에 GFP의 남성 1, 2 (: 유전자 X와 Punc - 54은 : Pdat - 1을 표현 : 체리) . 이것은 만들어진 세 개의 별도의 안정적인 라인 각각에 대해 개별적으로 수행되어야합니다. 이일 후 수컷을 제거합니다. </li><li> F1 세대를 검사, 여러 남성 자손이있다면, 교미를 성공적으로 완료했습니다. </li><li> 각 십자가에서 다섯 남녀 추니 L4 동물을 복제되는 전시 모두 Pdat - 1 : GFP 형광 마커 (남자 부모로부터 상속)과 Punc - 54 : 벚꽃 형광 바디 벽 근육 마커 (남녀 추니의 부모로부터 상속). 복제된 동물들은 아직 플레이트에있는 남자 동물 성관계를하지 않도록하기 위해 L4 단계에서해야합니다. 그들이 자기 ​​십자가와 F2 자손을 생산하도록 허용합니다. </li><li> 3 단계에서 생산 F2 동물 밖으로 복제됩니다. 특히, 전송 ~ 자신의 개인 접시에 두 형광 마커를 전시 5-10 동물. 화면 동물 표현 DA 뉴런에 GFP과 동물의 일부 100 % 신체 벽 근육 세포에 표현 벚꽃 아르 접시에 대한 F3 세대. 이러한 동물 Pdat - 1 homozygous 것입니다 : α - SYN, Pdat - 1 : GFP 유전자 안정 새로 만든 transgene (유전자 X)를 전송하는 동안. </li></ol> D. Dopaminergic 신경 세포 분석 <ol><li> 새로운 위에서 만든 세 줄의 각각의 접시뿐만 아니라 Pdat - 1을 준비 : α - SYN, Pdat - 1 : GFP 혼자 변형. 그들이 성인으로 성장할 수 있습니다. </li><li> 새로운 접시에 각 라인 30-40 형질 어른을 전송합니다. 그들은 20 º C. 4 시간 동안 태아를 낳기 위해 허용 </li><li> 어른을 제거합니다. 그들은 L4 단계에 도달할 때까지 배아가 20 º C에서 3-4일에 대한 개발을 허용합니다. </li><li> 0.04 MG / ML 5 - 플루오로 - 2&#39; - deoxyuridine (FUDR)이있는 접시로 ~ 100 유전자 변형 L4 동물을 선택하십시오. DNA 합성의 억제를 통해 다음 세대의 뉴클레오 티드 아날로그 블록 개발, 따라서 실험 동물 7 압도에서 자식을 방지. 그것이 가벼운 민감한이기 때문에 빛을에서 FUDR 번호판을 보호할 수 있습니다. </li><li> 성인 동물 계란 누워있는 다음과 같은 여러 일에 분석할 수 있습니다. 분석의 적절한 일은 경험적으로 결정됩니다. 예를 들어, 우리는 결정했다고 77%, 87 %, 그리고 Pdat - 1의 90 % : α - SYN, Pdat - 1 : GFP의 동물들이 각각, 일 6, 7 및 10 게시물 개발에서 퇴화한 검찰의 뉴런을 나타냅니다. 따라서, 우리가 관심의 transgene이 neurodegeneration을 강화 수도 예측한다면, 우리는 6 일 및 / 또는 7 분석합니다. 마찬가지로, neurodegeneration을 억제 수도 있습니다 transgenes은 7 일 10시 분석됩니다. </li><li> 4 신선한 아가로 오스 패드를 (microinjection의 한천 패드와는 달리, 이들은 신선한 사용하고 밖으로 건조 수 없습니다)합니다. 그들에 걸쳐 테이프의 조각을 두 가지 현미경 슬라이드를 설정하고, 테이프 equivalently 두꺼운 패드를위한 스페이서 역할을합니다. 3 분의 1을하다(그들은 세 나란히 위치에 있습니다) 벤치에서 그들 사이에 슬라이드. 중앙 슬라이드 용융 아가로 오스의 드롭을 장소와 빠르게 직각 세 슬라이드와 전체, 아가로 오스 상단에서 다른 슬라이드를하다. 패드를 사용할 준비가 될 때까지 함께 두 슬라이드를 떠나 여러 추가 패드하십시오. </li><li> 웜 검찰의 뉴런을 분석, 22 X 30mm 커버 유리 3 MM의 levamisole (마취)의 6 μl 방울을 넣으십시오. 아가로 오스 패드에 커버 유리 반전 후, 드롭으로 (10 30 이상의 추가 득점 수) 40 성인 동물을 선택하십시오. 다른 라인의 각각에 대해 반복합니다. </li><li> epifluorescence 및 FITC 또는 GFP의 시각화를 허용 필터 큐브와 복합 현미경을 사용하여 각 CEP 및 ADE 신경 세포의 존재에 대한 점수 줄에 30 동물. 우리는 GFP HYQ 필터 큐브를 (채도 기술) 부여를 사용하십시오. 첨부된 채점 시트에 기록 데이터입니다. 야생 동물 종류가 완료 모든 4 CEP에서 GFP의 형광 2 ADE의 뉴런을 유지합니다. DA의 뉴런의 손실을 전시 개별 동물은 아닌 WT 또는 &quot;degenerating&quot;로 득점 있습니다. 마찬가지로, 변성의 정도는 각 동물에서뿐만 아니라 인구로 잃은 총 뉴런를 세어 득점 수 있습니다. </li><li> 분석에게 두 번 이상 (시험 줄에 30 이상 동물)을 반복합니다. 분석의 3 라운드에서 야생 형 DA의 뉴런을 전시 웜의 총수는 평균입니다. neuroprotection에 대한 통계 분석은 다음 제어 웜 (: α - SYN, Pdat - 1 : Pdat - 1 : GFP)을 비교하는 학생의 T - 테스트 (P &lt;0.05)를 사용하여 수행됩니다 변종이있는 DA의 뉴런에 이상 - 특급 후보 유전자 . </li></ol>

<ol><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis-based+RNAi+screening+identifies+neuroprotective+genes+in+a+Parkinson%E2%80%99s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model.</a> PNAS. 105, 728-733 (2008).</li>
<li>Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-synuclein+blocks+ER-golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> PNAS. 105, 145-150 (2008).</li>
<li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Genomics%3A+A+Discovery-Based+Laboratory+Course%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course.</a> , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).</li>
</ol>

도파민 뉴런의 나이에 의존 손실이 파킨슨병의 임상적 특징이며 알파 synuclein이라는 단백질의 축적이나 misfolding와 연결되었습니다. 여기 C.의 dopaminergic 신경, 형광등 transgene을 통해, 레이블하는 방법을 보여줍니다 엘레간스 이러한 세포의 coexpressing 인간 알파 synuclein에 의해 파킨슨병에서 본 neurodegeneration을 모방. 이 동영상은 성장, 유전자 교차점, 장착 및 중 neurodegeneration을 강화하거나 노화의 과정을 통해 neuroprotection을 제공 유전 요인을 평가하기 위해 유전자 변형 nematodes의 점수에 대한 방법론을 묘사. 관리가 적절하게 신경 세포의 손실이나 보호를 채점에서 남성과 성공 유전자 교차하기 위해 나온것 개최하고, 일관성 유지를 위해 transgene 마커를 사용하여 촬영합니다. 이러한 방법으로, C. 엘레간스도 neurodegeneration에 기여하거나 향상시키는 신경 세포의 생존을 위해 치...

<table><tbody><tr><td>아가로스(Agarose)</td><td>초순수(Ultrapure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>커버글라스 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Plain, 3x1&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549</td><td></td></tr><tr><td>형광 해부</td><td>현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>해부</td><td>현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>에피형광</td><td>현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>Model E-800</td><td></td></tr><tr><td>필터 큐브, GFP HYQ</td><td>Endow Bandpass</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 c. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

파킨슨병 (PD)의 진단과 치료에 개선이 위험 인구를 렌더링 자화율 요인에 대한 지식에 의존하고 있습니다. 경찰과 관련된 새로운 유전자 요소를 식별하는 시도의 과정에서, 과학자들은 후보 유전자, polymorphisms, 중요한 진보를 대표하는 단백질의 많은 목록을 생성 있지만, 이러한 리드 mechanistically 정의되지 않은 상태로 유지됩니다. 우리 작품은 상당히 간단한 동물 모델 시스템의 장점을 이용하여 이러한 목록을 축소 방향으로 목표로하고 있습니다. 인간 뉴런 수십억을 가지고 있지만, 미세한 회 Caenorhabditis 엘레간스 정확하게 302을 가지고있는 hemaphrodites에서 단지 8 생산의 도파민 (DA). 투약 및 연령에 의존 neurodegeneration에 C. 엘레간스 DA 뉴런 결과에서 PD - 관련 단백질, 알파 synuclein를 인코딩 인간 유전자의 표현. DA의 뉴런 인간의 알파 synuclein을 표현하는 벌레는 isogenic하고 검찰의 전송 모터 (Pdat - 1)에서 GFP과 인간 알파 synuclein 모두를 표현한다. GFP의 존재이 동물에서 검찰의 neurodegeneration에 따라위한 쉽게 시각 마커 역할을합니다. 우리는 처음 알파 synuclein 유발 검찰 neurodegeneration가 torsinA, 분자 보호자 활동 1 단백질 이러한 동물 구출 수 있다고 보여주었다. 또한, 후보 PD 관련 유전자 그러면 C. 엘레간스 DA 뉴런의 과잉 표현했다 알파 synuclein의 misfolding 분석을 사용하여 대규모 RNAi 심사 노력을 통해 우리가 실험실에서 발견. 우리는 그들이 알파 synuclein - 유발 - DA neurodegeneration 2 구조로 다섯 일곱 유전자 PD의 대표 중요한 후보 변조기를 테스트 사실을 확인했습니다. 알파 synuclein에 의존 독성이 세포 독성을 강화하거나 억제 유전자에 대한 수 판독로 사용됩니다 의하여 또한, 린드 퀴 스트 연구소 (목성의 문제) 효모 화면을 수행했습니다. 우리는 이후의 C. 엘레간스 알파 synuclein - 유도 neurodegeneration 분석에 효모 후보 유전자 검사를하고 성공적으로 이러한 목표를 3, 4의 많은 검증. 우리의 방법론은 Pdat - 1 프로 모터의 제어하에 후보 유전자 cDNAs의 recombinational 복제를 사용하는 C. 엘레간스 DA 뉴런 특정 발현 벡터의 생성을 포함한다. 이러한 plasmids 그러면 성공적인 변환을위한 선택 마커와 함께 야생 타입 (N2) 벌레에 microinjected 있습니다. DA의 뉴런에서 후보 단백질을 생산하는 다수의 안정적인 유전자 변형 라인은 노화의 과정을 통해, 동물 및 개별 신경 세포 수준 모두에서, 취득 후 독립적으로 건너 알파 synuclein 퇴행성 변형에와 neurodegeneration에 대한 평가입니다.

이 동영상은 파킨슨병에 대한 모델로 dopaminergic 신경 세포의 neurodegeneration을 평가 C. 엘레간스를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한, 유전자 화면은 어느 변성을 향상 또는 neuroprotective 가지 요인을 식별하는 데 사용됩니다.

잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 C. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용

파킨슨병(PD)의 진단 및 치료 개선은 특정 인구 집단을 취약하게 만드는 감수성 요인에 대한 지식에 달려 있습니다...

Caldwell 연구실(일명 '웜 쉑(Worm Shack)')에서 우리는 *C. elegans*의 신경 질환 기전을 연구합니다. 그리고 성과 있는 실험으로 긴 하루를 보낸 후, 우리는 레크리에이션 활동으로 스스로에게 보상을 줍니다. 안녕하세요, 저는 앨라배마 대학교 생물과학과 Caldwell 연구실의 학부생 Adam Knight입니다.오늘 저와 동료들은 C. elegans에서 도파민 뉴런 퇴행 분석법을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 도파민 신경 퇴행성 웜 계통을 질병 관련 후보 유전자와 도파민 뉴런을 과발현하는 형질 전환 계통과 교배시킬 것입니다. 안녕하세요, Caldwell 연구실의 대학원생 Adam Harrington입니다.오늘은 도파민 뉴런 분석을 위한 형질전환 웜 설정 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 대학원생 Shu Amichi입니다. 여기에서는 CEP 및 ADE라고 불리는 C. elegans의 도파민 뉴런을 분석하는 방법을 보여드리겠습니다.일반적으로 도파민 신경세포에서 GFP만 발현하는 벌레들은 세포 사멸을 보이지 않습니다. 하지만 CLE가 존재할 때, 세포 사멸과 연령 의존적 신경 퇴행을 관찰할 수 있습니다. 이 분석법을 사용하여 도파민 신경세포에 외래 유전자를 공동 발현시킴으로써, 해당 유전자가 CLE로 유도된 독성을 강화하거나 억제할 수 있는지 결정할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.도파민 뉴런 분석을 수행하기 전, 먼저 적절한 GaN 계통을 교배시켜야 합니다. 도파민 뉴런 특이적 프로모터인 dat-1의 제어 하에 alphas nucle 및 GFP를 모두 발현하는 8마리의 밀을 교배 플레이트에 배치하십시오. 이제 우리가 관심 있는 후보 유전자의 도파민 뉴런 특이적 발현과 DS red two 형광 선택 마커의 체벽 근육 세포 발현을 보이는 L4 단계의 형질전환 ca 선충 2마리를 추가하십시오. 각 형질전환 컨스트럭트에 대해 3개의 안정적인 형질전환 라인을 생성한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.따라서 이 유전적 교배는 생성된 세 개의 개별 안정성 라인 각각에 대해 개별적으로 수행해야 합니다. 2일 후에 수컷을 제거하고, 추가로 2~3일이 지난 뒤 폐기하십시오. F1 세대를 검사하십시오.여러 마리의 수컷 자손이 생성되었으며 교배가 성공적으로 이루어졌습니다. 다음으로, 수컷 부모로부터 물려받은 GFP 형광 마커와 hamadi 부모로부터 물려받은 DS red two 형광 체벽 근육 마커를 모두 나타내는 개체를 각 교배 조합당 4마리씩 선택하여 Aphrodite L4 새 플레이트로 각각 옮깁니다. 옮겨진 개체들은 아직 교미하지 않았음을 보장하기 위해 L4 단계여야 합니다.플레이트에 수컷 동물이 있는 상태에서, F2 자손을 생성할 수 있도록 3~4일 동안 동물들이 자가 수정하게 둡니다. 이제 F2 자손을 선별합니다. 두 가지 중심 표지(cent markers)를 모두 나타내는 동물 5~10마리를 각각 개별 플레이트로 옮깁니다.그 후 F3 세대를 스크리닝하여 동물의 100%가 도파민 뉴런에서 GFP를 발현하고, 일부 동물은 체벽 근육 세포에서 DS red two 형광 마커를 발현하는 플레이트를 선별합니다. 이러한 동물들은 alpha synuclein과 GFP 유전자에 대해 동형접합체이며, 새로 제작된 트랜스진을 안정적으로 전달하게 됩니다. 스크리닝이 완료되면 도파민성 뉴런 분석을 수행할 준비가 된 것입니다.뉴런 분석을 시작하려면, 이전 단계에서 확인한 세 마리의 F3 동물을 사용하여 새로운 플레이트를 준비하십시오. 세 가지 형질전환 라인 각각에 대해 플레이트를 구성하십시오. 또한, 대조군으로 alpha-synuclein GFP 단독 균주를 플레이트에 배양하여 벌레가 성체로 성장할 때까지 기다리십시오.벌레가 성체에 도달하면, 각 라인에서 30~40마리의 형질전환 동물을 새 플레이트로 옮깁니다. 20 °C에서 5시간 동안 알을 낳도록 둡니다. 5시간 후, 성체를 제거하여 폐기합니다.성체는 배아가 L4 단계에 도달할 때까지 20 °C에서 3~4일 동안 발달하도록 둡니다. 다음으로, 0.04 mg/mL의 5-fluoro-2'-deoxyuridine이 포함된 플레이트에 형질전환된 L4 동물 약 100마리를 옮깁니다.이 뉴클레오타이드 유사체는 DNA 합성을 억제하여 다음 세대의 발생을 방지합니다. FDUR 플레이트는 빛에 민감하므로, 플레이트를 덮개로 덮고 완전히 감싸 빛으로부터 보호하십시오. 벌레 분석을 위한 aug gross 패드를 제작하십시오.이것들은 신선한 상태로 사용하며 건조되지 않도록 해야 합니다. 테이프 조각이 길이 방향으로 붙어 있는 현미경 슬라이드 2개를 준비합니다. 테이프는 동일한 두께의 패드를 만들기 위한 스페이서 역할을 합니다.그 사이에 세 번째 슬라이드를 벤치 위에 놓습니다. 이제 슬라이드들이 나란히 세 개 배치되었습니다.녹은 agar 한 방울을 슬라이드 중앙에 떨어뜨리고, 그 위에 다른 슬라이드를 수직으로 놓고 세 개의 슬라이드 모두를 가로질러 빠르게 덮습니다. 분석할 샘플 수에 필요한 만큼 agar 패드를 여러 개 더 만듭니다. agar 패드가 준비되면, 22 by 30 mm 커버 글라스 위에 3 mM의 11-mile saw 및 마취제 6 µL 한 방울을 떨어뜨립니다.성체 동물 40마리를 방울 안으로 옮긴 후, 커버 글라스를 agros 패드 위에 뒤집어 놓습니다. 다른 각 라인에 대해서도 동일하게 반복합니다. 라인당 30마리의 동물을 대상으로 각 CEP 및 D 뉴런의 존재 여부를 판정합니다.FITC 또는 GFP의 시각화가 가능한 필터 큐브가 장착된 에피 형광 복합 현미경을 사용하여, endo G-F-P-H-Y-Q 필터 큐브로 데이터를 기록하고 스코어 시트에 작성합니다. 야생형 동물은 4개의 모든 CEP 뉴런과 2개의 ADE 뉴런에서 GFP가 완전히 유지됩니다. D 뉴런의 소실이 나타나는 개별 동물은 기지의 야생형 또는 퇴행성으로 판정합니다.이러한 뉴런은 LG 또는 GFP 소실로 기록됩니다. 마찬가지로, 각 동물에서 소실된 총 뉴런 수를 세어 퇴행 정도를 측정할 수 있으며, 분석 인구 집단을 대상으로 이 분석을 두 번 더 반복합니다. 시험당 라인별로 30마리의 동물을 추가로 사용합니다.세 차례의 분석에서 야생형 도파민 뉴런을 나타내는 벌레의 총 수를 평균냅니다. 이후 학생 T-검정(Student's T-test)을 사용하여 P 값이 0.05 미만인 경우를 기준으로 신경 보호 효과에 대한 통계 분석을 수행합니다. 대조군 벌레와 도파민 뉴런에서 후보 유전자를 과발현하는 균주를 비교하기 위해, 알 부화 후 적절한 분석 일수를 경험적으로 결정하여 여러 날에 걸쳐 이 분석을 수행합니다.예를 들어, alpha CLE와 GFP가 발현된 동물들의 77%, 87%, 90%가 각각 발달 후 6일, 7일, 10일에 도파민 뉴런의 퇴행을 나타내는 것을 확인하였습니다. 따라서, 분석 대상인 트랜스진이 신경 퇴행을 촉진할 것으로 예측되는 경우에는 6일 차에 분석을 진행합니다. 마찬가지로, 신경 퇴행을 억제할 것으로 예측되는 트랜스진은 7일과 10일 차에 분석합니다.지금까지 C. elegans를 이용한 도파민 신경퇴행 분석법의 수행 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때 기억해야 할 중요한 사항은 첫째, 유전적 교배 시 선택을 위해 적절한 마커를 사용하는 것입니다. 둘째, 교배를 위해 건강한 수컷과 L4 단계의 허밍버드(HEDIS)를 사용하는 것입니다.셋째, CEP와 DE 뉴런을 신중하고 일관되게 점수화하십시오. 이 절차를 통해 alpha-CLE에 의해 유도되는 신경 퇴행을 강화하거나 억제할 수 있는 유전적 인자를 신속하게 분석할 수 있습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

일반적으로 파킨슨 병 및 운동 장애에 민감하고 안정적​​인 행동 분석은 새로운 잠재적 인 치료를 테스트하기 위해 필수적입니다. 여기, 우리는 흑질 선조체 시스템에 손상의 정도를 변화와 전임상 연구에 유용에 민감한 쥐를위한 감각 테스트의 관리 배터리를 설명합니다.

파킨슨 병의 마우스 모델에서 감각 기능의 평가

여기에 우리가있는 도파민 (DA) 신경 세포의 연령에 따라 신경 변성을 연구하기 위해 설립 된 두 가지 분석을...

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

Lipoxygenase (LOX) isozymes 증가 또는 증가 시킬 수 있는 제품을 생성할 수 있습니다 또는 신경 염증 및 신경 변성. 유전자 환경 상호 작용 연구 LOX isozyme 특이적 효과 식별할 수 있습니다. 두 개의 LOX isozyme-결핍 형 형질 라인에서 니그로스트리아탈 손상의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 모델을 사용하면 도파미너기크 및 염증에 대한 LOX 이소지메의 기여도를 비교할 수 있습니다.

파킨슨 병에서 감수성 메커니즘을 마스크를 해제하는 유전자 환경 상호 작용 모델

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

여기에서, 우리는 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 세포 및 분자 기초를 모니터링하고 해부하기 위해 과활성화 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 골재 유도 신경 독성을 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 널리 접근 할 수있는 방법론을 소개하고 설명합니다.

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

여기에서는 쥐의 증가된 크기와 무게를 수용하기 위해 MouseWalker 장치를 재설계하여 구축된 RatWalker 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 좌절된 전체 내부 반사(FTIR), 고속 비디오 캡처 및 오픈 액세스 분석 소프트웨어를 사용하여 보행 매개변수를 추적하고 정량화합니다.

파킨슨병의 유전적 쥐 모델에서 보행 분석을 위한 RatWalker 시스템 적용

이 기사에서는 7점 득점 시스템을 사용하여 C. elegans의도파민성 뉴런 원간 형태에 대한 변경 사항을 일관되게 정량화하는 방법을 소개합니다. 이 시스템은 유전, 화학 및 신경 퇴행성 질환의 노화 기반 모델을 활용한 도파민성 신경 변성 분석의 분석을 위한 것입니다.

Caenorhabditis elegans에서 도파민인체학 뉴런 형태 학적 변경 및 변성의 수준을 정량화

이 프로토콜은 인간 중뇌 도파민 뉴런의 세포 배양에 이어 면역학적 염색 및 획득된 현미경 high-content 이미지에서 신경 세포 표현형 프로파일 생성을 설명하여 유전적 또는 화학적 조절로 인한 표현형 변이를 식별할 수 있습니다.

인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링

이 프로토콜은 젊은 RAC1/CED-10 돌연변이 Caenorhabditis elegans에서의 정량적 배변 검사를 상세히 다루며, 전염성 파킨슨병 병기를 연구할 수 있는 간단한 모델을 제공합니다. 이 방법은 다른 동물 모델의 한계를 극복하고 초기 파킨슨병리를 표적으로 하는 치료 전략 시험을 용이하게 합니다.

초기 파킨슨병 연구 도구로서 Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 돌연변이의 위장 운동성 평가

올 Isacson는 간결한 파킨슨스의 질병의 개요, 그 원인, 치료 전략, 파킨슨병 연구에 발전을 제공합니다.

올 Isacson : 파킨슨병을위한 새로운 요법 개발

배우세요 C. elegans를 활용한 도파민 신경 세포 변성 분석 방법으로 파킨슨병 유전자를 검증하는 기술입니다. 유전자 스크리닝을 통해 신경 보호 요인을 식별할 수 있습니다.

잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 C. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용

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