잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 C. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용

Caldwell 연구실(일명 Worm Shack)에서 저희는 C. elegans의 신경 질환 기전을 연구합니다. 그리고 결실 있는 실험으로 가득했던 긴 하루를 마친 뒤, 저희는 여가 활동을 통해 스스로에게 보상을 줍니다. 안녕하세요, 저는 앨라배마 대학교 생물과학과의 Caldwell 연구실 학부생 Adam Knight입니다.

오늘 저와 동료들이 C. elegans에서 도파민 뉴런 퇴행 분석을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 도파민 신경퇴행성 웜 균주를 질병 관련 후보 유전자와 도파민 뉴런을 과발현하는 형질전환 균주와 교배시킬 예정입니다. 안녕하세요, 저는 Caldwell 연구실의 대학원생 Adam Harrington입니다.

오늘은 도파민 뉴런 분석을 위한 형질전환 웜의 설정 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 대학원생 Shu Amichi입니다. 여기서는 CEP와 ADE라고 불리는 C. elegans의 도파민 뉴런을 분석하는 방법을 보여드리겠습니다.

일반적으로 도파민 뉴런에서 GFP만 발현하는 벌레는 세포 사멸을 보이지 않습니다. 하지만 CLE가 존재하면 세포 사멸과 연령 의존적 신경 퇴행이 관찰됩니다. 이 분석법을 사용하여, 도파민 뉴런에서 외래 유전자를 공동 발현시킴으로써 해당 유전자가 CLE로 유도된 독성을 강화하는지 또는 억제하는지 결정할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다.

도파민 뉴런 분석을 수행하기 전, 먼저 적절한 GaN 균주를 교배시켜야 합니다. 도파민 뉴런 특이적 프로모터 dat 1의 제어 하에 alphas nucle과 GFP를 모두 발현하는 8마리의 수컷을 교배 플레이트에 배치하십시오. 이제 우리가 관심 있는 후보 유전자의 도파민 뉴런 특이적 발현과 DS red two 형광 선택 마커의 체벽 근육 세포 발현을 모두 나타내는 L4 단계의 형질전환 ca 암컷 2마리를 추가하십시오. 각 형질전환 컨스트럭트마다 3개의 안정적인 형질전환 라인을 생성한다는 점에 유의하십시오.

따라서 이 유전적 교배는 생성된 세 개의 독립적인 안정성 라인 각각에 대해 개별적으로 수행해야 합니다. 2일 후, 추가로 2~3일이 더 지나면 수컷을 제거하여 폐기하십시오. F1 세대를 검사하십시오.

여러 마리의 수컷 자손이 나타났으며 교배가 성공적으로 이루어졌습니다. 다음으로, 수컷 부모로부터 물려받은 GFP 형광 마커와 hamadi 부모로부터 물려받은 DS red two 형광 체벽 근육 마커를 모두 나타내는 개체를 각 교배 조합당 4마리씩, 총 5마리를 새로운 플레이트로 개별적으로 옮깁니다. 옮겨지는 동물들은 아직 성체(M)가 되지 않았음을 보장하기 위해 L4 단계여야 합니다.

수컷 동물들이 플레이트에 있는 상태에서, F2 자손을 생성하도록 3~4일 동안 자가 수정시키십시오. 이제 F2 자손을 선별해야 합니다. 두 가지 표지자를 모두 나타내는 동물 5~10마리를 각각 개별 플레이트로 옮기십시오.

그 다음 F3 세대를 스크리닝하여, 모든 개체의 도파민 뉴런에서 GFP가 발현되고 일부 개체에서는 체벽 근육 세포에서 DsRed2 형광 마커가 발현되는 플레이트를 선별합니다. 이 개체들은 alpha-synuclein 및 GFP 유전자에 대해 동형 접합체이며, 새로 생성된 트랜스진을 안정적으로 전달하게 됩니다. 스크리닝이 완료되면 도파민성 뉴런 분석을 수행할 준비가 된 것입니다.

뉴런 분석을 시작하려면, 이전 단계에서 확인한 3마리의 동물을 사용하여 신선한 플레이트를 준비하십시오. 3가지 형질전환 라인 각각에 대해 플레이트를 설정합니다. 또한, 대조군으로서 alpha-synuclein GFP 단독 발현 균주를 함께 플레이팅하고, 벌레가 성체로 성장할 때까지 배양합니다.

벌레가 성체에 도달하면, 각 라인에서 30~40마리의 형질전환 동물을 새 플레이트로 옮깁니다. 20 °C에서 5시간 동안 알을 낳도록 둡니다. 5시간 후, 성체를 제거하여 폐기합니다.

성체에서 배아가 20°C에서 3~4일 동안 L4 단계에 도달할 때까지 발달하도록 둡니다. 그다음, 형질전환된 L4 개체 약 100마리를 0.04 mg/mL의 5-fluoro-2'-deoxyuridine이 포함된 플레이트로 옮깁니다.

이 뉴클레오타이드 유사체는 DNA 합성을 억제하여 다음 세대의 발달을 방지합니다. FDUR 플레이트는 빛에 민감하므로, 플레이트를 덮개로 덮고 완전히 감싸어 빛으로부터 보호하십시오. 벌레 분석을 위해 agar gross 패드를 제작하십시오.

이것들은 건조되지 않도록 신선한 상태로 사용해야 합니다. 테이프 조각이 세로 방향으로 붙어 있는 현미경 슬라이드 두 개를 준비하십시오. 테이프는 동일한 두께의 패드를 만들기 위한 스페이서 역할을 합니다.

그 사이에 세 번째 슬라이드를 벤치 위에 놓습니다. 이제 슬라이드들이 나란히 세 개 배치되었습니다.

녹은 agar 한 방울을 슬라이드 중심에 떨어뜨리고, 그 위에 다른 슬라이드를 수직으로 빠르게 겹쳐 세 개의 슬라이드 전체에 걸쳐 배치합니다. 분석할 샘플 수에 필요한 만큼 충분한 수의 agar 패드를 만들기 위해 이 과정을 반복합니다. agar 패드가 준비되면, 22 by 30 mm 커버 글라스 위에 3 mM MS 220 및 마취제 6 µL 한 방울을 떨어뜨립니다.

성체 동물 40마리를 한 방울로 옮긴 후, 커버 글라스를 agros 패드 위에 뒤집어 덮습니다. 다른 각 라인에 대해서도 동일하게 반복합니다. 라인당 30마리의 동물을 관찰하여 각 CEP와 D 뉴런의 존재 여부를 판정합니다.

FITC 또는 GFP의 시각화가 가능한 필터 큐브가 장착된 에피 형광 복합 현미경을 사용하여, endo G-F-P-H-Y-Q 필터 큐브를 이용해 데이터를 기록지에 기록합니다. 야생형 동물은 4개의 모든 CEP 뉴런과 2개의 A DE 뉴런에서 완전한 GFP를 유지합니다. D 뉴런의 소실을 보이는 개별 동물은 알려진 야생형 또는 퇴행성으로 판정합니다.

이러한 뉴런들은 GFP 소실(loss of GFP) 또는 LG로 기록됩니다. 마찬가지로, 각 동물에서 손실된 총 뉴런 수와 개체군을 계산하여 퇴행 정도를 측정할 수 있으며, 이 분석을 두 번 더 반복합니다. 각 시험당 라인별로 30마리의 동물을 추가로 사용합니다.

세 차례의 분석에서 야생형 도파민 뉴런을 나타내는 벌레의 총 수를 평균합니다. 이후 학생 t-검정(student's T-test)을 사용하여 P값이 0.05 미만인 경우를 신경 보호에 대한 통계적 분석으로 수행합니다. 대조군 벌레와 도파민 뉴런에서 후보 유전자를 과발현하는 균주를 비교하기 위해, 산란 후 여러 날에 걸쳐 이 분석을 수행하며, 분석에 적합한 날짜는 경험적으로 결정합니다.

예를 들어, alpha CLE-GFP 형질전환 동물의 경우 발생 후 6일, 7일, 10일째에 각각 77%, 87%, 90%에서 도파민 뉴런의 퇴행이 나타나는 것을 확인하였습니다. 따라서 관심 있는 형질전환 유전자가 신경퇴행을 촉진할 것으로 예측되는 경우에는 6일째에 분석을 진행하며, 반대로 신경퇴행을 억제할 것으로 예측되는 유전자의 경우에는 7일 및 10일째에 분석을 진행합니다.

지금까지 C. elegans에서 도파민 신경퇴행 분석을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때 주의할 점은 첫째, 유전적 교배 시 선택을 위해 적절한 마커를 사용해야 한다는 것입니다. 둘째, 교배를 위해 건강한 수컷과 L4 단계의 hermaphrodite를 사용하십시오.

마지막으로, CEP와 DE 뉴런을 세심하고 일관되게 스코어링하십시오. 이 절차를 통해 alpha alpha CLE로 유도된 신경 퇴행을 강화하거나 억제할 수 있는 유전적 요인을 신속하게 분석할 수 있습니다. 이것으로 모두 마쳤습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.