잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 C. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용

콜드웰 랩(Caldwell Lab, 일명 웜 쉑(Worm Shack)에서는 바다의 우아함(sea elegance)에 대한 신경 질환 메커니즘을 연구합니다. 그리고 하루 종일 유익한 실험을 한 후, 우리는 몇 가지 레크리에이션 활동으로 스스로에게 보상합니다. 안녕하세요, 저는 앨라배마 대학교 생명과학과 칼웰 연구소의 학부생인 아담 나이트입니다.

오늘 저와 다른 사람들은 C Elegants에서 도파민 뉴런 변성 분석을 수행하는 방법을 보여줄 것입니다. 저는 도파민 신경퇴행성 웜 균주와 후보 질병 관련 유전자 및 도파민 뉴런을 과발현하는 형질전환 균주를 교차시킬 것입니다. 안녕하세요, 저는 콜드웰 연구실의 대학원생인 아담 해링턴입니다.

오늘은 도파민 뉴런 분석을 위해 형질전환 웜을 설정하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 대학원생인 Shu Amichi입니다. 여기에서는 ceps 및 aides라고 하는 C 우아함의 도파민 뉴런을 입력하는 방법을 보여 드리겠습니다.

일반적으로 도파민 뉴런에서 GFP만 발현하는 기생충은 세포 사멸을 나타내지 않습니다. 그러나 CLE가 있는 경우 이러한 노화 및 연령 의존적 신경 퇴행을 관찰할 수 있습니다.이 분석을 사용하면 전이유전자가 도파민 뉴런에서 동시 발현되어 CLE 유도 독성을 강화하거나 억제할 수 있는지 여부를 결정할 수 있습니다. 시작하겠습니다.

도파민 뉴런 분석을 수행하기 전에, 우리는 먼저 적절한 GaN 균주를 교차하여 도파민 뉴런 특이적 프로모터 dat one의 제어 하에 알파 핵과 GFP를 모두 발현하는 8개의 밀을 짝짓기 플레이트에 배치하기 시작해야 합니다. 이제 관심 후보 유전자의 도파민 뉴런 특이적 발현을 나타내는 2개의 L 4단계 형질전환 ca 아프로디테와 DS 빨간색 2개의 형광 선택 가능 마커의 체벽 근육 세포 발현을 추가합니다. 각 transgene 구조체에 대해 3개의 안정적인 형질전환 라인을 생성한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

따라서 이 유전적 교배는 생성된 3개의 분리된 안정된 라인 각각에 대해 개별적으로 수행되어야 합니다. 2일 후, 추가로 2-3일 후에 수컷을 제거하고 버립니다. F1 세대를 검사합니다.

여러 명의 수컷 자손이 있으며 짝짓기는 성공적이었습니다. 다음으로, 수컷 부모로부터 물려받은 GFP 형광 마커와 하마디 부모로부터 물려받은 DS 빨간색 2개의 형광 체벽 근육 마커를 모두 나타내는 각 십자가의 동물 4마리를 아프로디테 L의 새 플레이트로 개별적으로 옮깁니다. 옮겨진 동물은 아직 M이 없는지 확인하기 위해 L 4단계에 있어야 합니다.

수컷 동물이 접시에 있는 상태에서 동물이 3-4일 동안 자가 수정을 하여 F 두 자손을 생산하도록 합니다. 이제 이렇게하려면 F 두 자손을 정리하십시오. 두 센트 마커를 모두 보이는 5-10마리의 동물을 자신의 개별 플레이트로 옮깁니다.

그런 다음 동물의 100%가 도파민 뉴런에서 GFP를 발현하고 일부 동물이 DS 적색 2개의 형광 마커와 체벽 근육 세포를 발현하는 플레이트에 대해 F 3세대를 스크리닝합니다. 이 동물들은 알파 시누클레인(alpha synuclein)과 GFP 유전자에 대해 동형접합적(homozygous)일 것이며, 또한 새로 생성된 전이유전자를 안정적으로 전달할 것입니다. 스크리닝이 완료되면 도파민 뉴런 분석을 수행할 준비가 된 것입니다.

뉴런 분석을 시작하려면 이전 단계에서 식별된 세 동물의 F 플레이트를 새로 준비합니다. 세 가지 형질전환 라인 각각에 대해 플레이트를 설정합니다. 더하여, 알파 synuclein GFP 혼자 긴장은 대조군으로 벌레가 성인기에 성장하는 것을 허용합니다.

기생충이 성충이 되면 각 계통에서 30-40마리의 형질전환 동물을 새 접시에 옮깁니다. 섭씨 20도에서 5시간 동안 알을 낳도록 합니다. 5시간 후에 제거하고 폐기하십시오.

성체는 배아가 L 4기에 도달할 때까지 섭씨 20도에서 3-4일 동안 발달하도록 합니다. 다음으로, 약 100마리의 형질전환 L 4마리를 5개의 플루오로 1밀리리터당 0.04밀리그램이 들어 있는 플레이트에 넣습니다. 두 개의 데옥시 우리딘.

이 뉴클레오티드 유사체는 DNA 합성의 억제를 통해 다음 세대의 발달을 방지합니다. FDUR 플레이트는 빛에 민감하므로 플레이트를 덮고 완전히 감싸서 빛으로부터 보호하십시오. 웜 분석을 위해 aug gross pad를 만듭니다.

이들은 신선하게 사용되며 건조되지 않습니다. 테이프가 가로질러 있는 두 개의 현미경 슬라이드를 놓습니다. 세로로. 이 테이프는 동일한 두께의 패드를 위한 스페이서 역할을 합니다.

벤치에서 그들 사이에 세 번째 슬라이드를 놓습니다. 그들은 배치되어 있습니다. 3개 나란히.

중앙면에 용융된 아루스 한 방울을 놓고 수직 2 개의 아그로스 위와 3 개의 슬라이드 모두에 걸쳐 다른 슬라이드를 빠르게 놓습니다. 반복하여 분석할 샘플 수에 필요한 만큼 여러 개의 추가 패드를 만듭니다. 오거 패드가 준비되면 22 x 30mm 커버 유리에 3밀리몰, 11마일 톱 및 마취제를 6마이크로리터 방울 떨어뜨립니다.

40마리의 성체 동물을 드롭에 넣은 다음 덮개 유리를 아그로스 패드에 뒤집습니다. 다른 각 줄에 대해 반복합니다. 각 CEP와 D 뉴런의 존재에 대해 라인당 30마리의 동물에 점수를 매깁니다.

FITC 또는 GFP를 시각화할 수 있는 필터 큐브에서 에피 형광이 있는 복합 현미경을 사용하여 채점 시트에 엔도 G-F-P-H-Y-Q 필터 큐브 기록 데이터를 사용합니다. 야생형 동물은 4개의 CEP 뉴런과 2개의 A DE 뉴런 모두에서 수업을 위해 완전한 GFP를 유지합니다. D 뉴런의 소실을 보이는 개별 동물은 알려진 야생형 또는 퇴화로 점수가 매겨집니다.

이 뉴런은 LG 또는 GFP 손실로 기록됩니다. 마찬가지로, 퇴화의 정도는 각 동물에서 손실된 총 뉴런을 세어 점수를 매길 수 있을 뿐만 아니라 개체군이 분석을 두 번 더 반복합니다. 시험당 라인당 30마리 이상의 동물을 사용합니다.

세 차례의 분석에서 야생형 도파민 뉴런을 보이는 웜의 총 수를 평균화합니다. 그런 다음 학생의 T-테스트 P 값이 0.05 미만인 것을 사용하여 신경 보호에 대한 통계 분석을 수행합니다. 도파민 뉴런에서 후보 유전자를 과발현하는 균주와 대조군 웜을 비교하기 위해 알 레인 이후 다양한 날에 대한 분석을 수행하고, 경험적으로 결정된 분석의 적절한 날을 분석합니다.

예를 들어, 알파 CLE와 GFP 동물의 77%87%와 90%가 발달 후 6일, 7일, 10일째에 각각 퇴화된 도파민 뉴런을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 따라서 관심 있는 전이유전자가 신경 퇴행을 향상시킬 수 있다고 예측하면 6일째에 분석할 것입니다. 마찬가지로, 신경 퇴행을 억제할 수 있는 전이유전자는 7일과 10일에 분석될 것입니다.

우리는 방금 바다 우아함에서 도파민 신경 퇴행 분석을 수행하는 방법을 보여 드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 유전자 교배 중 선택을 위해 적절한 마커를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 둘째, 건강한 수컷을 사용하고 십자가에는 L 4 HEDIS를 사용하십시오.

셋째, CEP와 DE 뉴런에 신중하고 일관되게 점수를 매기십시오. 이 절차를 통해 알파 알파 CLE에 의한 신경 퇴행을 강화하거나 억제할 수 있는 유전적 요인을 신속하게 분석할 수 있습니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.