Name: C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-18T17:08:00.000+00:00
Duration: 18 min 1 s
Description: 학습하세요 C. elegans를 이용한 시냅스 전송 돌연변이의 약리학적 특성 분석 방법을. 알디카브와 PTZ를 활용한 이 기법은 신경과학 및 간질 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 천의 월, 국립 과학 재단에서 GAC에 직업 상부터 바질 오코너 학술 상뿐만 아니라, 하워드 휴즈 의학 연구소에서 앨러배마 대학 학사 연구 과학 프로그램 그랜트의 연결을 흥분과이 자금이 콜드웰 연구소의 간질 연구.

Aldicarb 노출 패러다임 <ol><li> 첫날, 각 유전자형의 각 복제의 적어도 30 젊은 성인 단계 웜은 두 번째 하루에 aldicarb assays에 대해 사용할 수 있는지 확인하십시오. 실험자들이 E.를 포함하는 신선한 NGM 플레이트에 오십 이상 L4 무대 웜을 (최고 nystatin 제외), 선택한다면 그것은 최고 식품 소스로 대장균 (선호 OP50), 그리고 일관성 있고 허용 온도 (20 ° 22 ° C 25 ° C 괜찮 있지만 C는 최고입니다.)에서 12-24시간 그들을 성장 </li><li> 두 번째 날, 70 % 에탄올 (EtOH) 30 % ddH 2 O.과 aldicarb의 100 MM 주식 솔루션을 원하는 aldicarb의 농도를 달성하기 위해 정의된 볼륨 NGM 마이너스 nystatin 접시에 aldicarb의 해당 금액을 확산. 우리는 지속적으로 7.5 ML의 NGM 플레이트에 도금 100 MM의 aldicarb의 37.5 μL를 0.5 MM의 aldicarb를 사용합니다. aldicarb 플레이트는 실온에서 약 30~60분에 대한 건조하실 수 있습니다. 그것은 피부를 깰 필요는 없습니다. 또는 aldicarb은 NGM에 추가하고 4 ° C 일주일 동안 저장할 수 있습니다. &nbsp;</li><li> E.의 건조, 접시 일관성있는 볼륨 후 각 aldicarb 판의 중심과 실온에서 다른 30-60분에 대한 건조에 대장균 (선호 OP50). 인구 과잉없이 작은 자리에 집중 벌레를 유지하기 위해 충분히 크기의 음식 론을 만들어 우리는 지속적으로 판 OP50 25 μL를. &nbsp;</li><li> 음식 잔디가 건조되면, 하나는 aldicarb의 assays 진행됩니다. aldicarb의 assays의 주관적 특성으로 인해, 그것은 매우 실험은 &quot;맹목적으로&quot;수행하는 것이 좋습니다. 기본 실험자의 동료 assayed 수 벌레와 함께 원래의 접시를 다시 레이블 수 있습니다. 마찬가지로, 동료는 타이머를 시작하기 전에 즉시 원래의 접시에서 계산된 aldicarb 플레이트로 웜을 전송 수 있습니다. 실험자 이러한 uncoordination 같은 특성 표현형와 벌레의 특정 긴장을 시금 예상한다면, 역시 편견을 줄이기 위해 유사한 표현형있는 컨트롤이 있어야합니다. 또한 실험자들이 assays 실험을 표준화 도움이 병렬로 야생 형 변형뿐만 아니라 저항 변형과 지나치게 긴장을하면 좋습니다. 실험자는 각 복제에 대한 웜의 일관된 번호를 분석하기 위해 노력한다. 우리는 지속적으로 각 복제에 대한 단일 유전자형 서른 벌레를 분석할 수 있습니다. 우리는 또한 적어도 세를 수행하면 각 실험에 대한 복제. 경험 실험자 한 번에 최소 6 계통을 분석 할 수 있어야합니다. &nbsp;</li><li> 백금 와이어 각 벌레 일관된 방식으로 괴롭히는 의해 마비 벌레의 수를 계산합니다. 우리는 지속적으로 두 번 머리에 두 번 꼬리 3 시간 총 30 분 간격에 우리의 벌레를 찌르다. pharyngeal 펌프의 정지 또한 실험자 모든 assays 이상 마비의 일관된 정의를 고용하는 경우에만 마비를 정의하는 데 사용하지만 수 있습니다. 또한, 특히 일부 웜, aldicarb에 강한하는 사람이 접시를 크롤 링을 시도할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 경우에는 실험자의 aldicarb 접시 주위에, 팔미트산, 웜 운동에 대한 물리적 장벽의 일관된 금액을 확산 수 있습니다. 우린 10 MG 팔미트산 / ML EtOH 25 μL를 확산. </li></ol> PTZ 노출 패러다임 <ol><li> 첫날, 각 유전자형의 각 복제의 적어도 30 젊은 성인 단계 웜은 두 번째 날에 PTZ의 assays에 대해 사용할 수 있는지 확인하십시오. 실험자들이 E.를 포함하는 신선한 NGM 플레이트에 오십 이상 L4 무대 웜을 (최고 nystatin 제외), 선택한다면 그것은 최고 식품 소스로 대장균 (선호 OP50), 그리고 일관성 있고 허용 온도 (20 ° 22 ° C 25 ° C 괜찮 있지만 C는 최고입니다.)에서 12-24시간 그들을 성장 </li><li> 둘째 날에는, PTZ의 0.5 g PTZ / ML ddH 2 O 주식 솔루션을합니다. 원하는 PTZ의 농도를 달성하기 위해 NGM 마이너스 정의된 볼륨 nystatin 플레이트에 PTZ의 해당 금액을 확산. 우리가 PTZ에 대한 선량 - 반응 assays을 선호하기 때문에, 우리는 플레이트 7.5 ML의 NGM 플레이트에 PTZ의 양의 변화. 예를 들어, 한 접시 7.5 ML의 NGM 판에 PTZ 주식 솔루션의 37.5 μL 수 있습니다 5 MG PTZ / ML 솔루션을 만들 수 있습니다. PTZ 플레이트는 실온에서 약 60~1백20분에 대한 건조하실 수 있습니다. 그것은 피부를 깰 필요는 없습니다. 또는, PTZ는 NGM에 직접 추가할 수 있지만, 그것은 바로 응고 후 assays 사용해야합니다. PTZ의 안정성 aldicarb보다 훨씬 적습니다. 따라서, 기존의 PTZ 번호판과 assays 덜 믿을 수 있습니다. PTZ는 사용하기 전에 건조 에이전트와 건조기에서 -20 ° C에서 저장해야합니다. 우리는 안정성을 보장하기 위해 여는 후 약 이개월 PTZ을 삭제하는 것을 선호합니다. </li><li> E.의 건조, 접시 일관성있는 볼륨 후 대장균 (선호 OP50)각 PTZ 플레이트와 실온에서 다른 30-60분에 대한 건조의 중심지로. 인구 과잉없이 작은 자리에 집중 벌레를 유지하기 위해 충분히 크기의 음식 론을 만들어 우리는 지속적으로 판 OP50 25 μL를. &nbsp;</li><li> 음식 잔디가 건조되면, 하나는 PTZ의 assays 진행됩니다. PTZ의 assays가 aldicarb의 assays보다 주관적이지만, 그것은 여전히​​ 매우 실험은 &quot;맹목적으로&quot;수행하는 것이 좋습니다. 기본 실험자의 동료 assayed 수 벌레와 함께 원래의 접시를 다시 레이블 수 있습니다. 마찬가지로, 동료는 타이머를 시작하기 전에 즉시 원래의 접시에서 계산된 PTZ 플레이트로 웜을 전송 수 있습니다. 실험자 이러한 uncoordination 같은 특성 표현형와 벌레의 특정 긴장을 시금 예상한다면, 역시 편견을 줄이기 위해 유사한 표현형있는 컨트롤이 있어야합니다. 또한, 그것은 실험자들이 assays 실험을 표준화 도움이 병렬로 앞쪽에 또는 전신 경련과 야생 타입 변형뿐만 아니라 종자를하면 좋습니다. 실험자는 각 복제에 대한 웜의 일관된 번호를 분석하기 위해 노력한다. 우리는 지속적으로 각 복제에 대한 단일 유전자형 서른 벌레를 분석할 수 있습니다. 우리는 또한 적어도 세를 수행하면 각 실험에 대한 복제. 경험 실험자 한 번에 적어도 세 계통을 분석 할 수 있어야합니다. 벌레가 약물에 적응을 마비되거나, 어떤 경우에, 아직은, 다음 PTZ - 유도된 노출 15-30분 사이에 일반적으로 정상 경련, 그리고 빈도와 강도가 감쇠. </li><li> 1 시간 총 &quot;간질 같은&quot;벌레를 경련을 30 분 간격의 개수를 계산합니다. 그것은 전신 경련, 전신 마비, 우리는 &quot;토닉&quot;전화 또는 조합 벌레의 수를 별도로, 우리는 &quot;머리 밥스&quot;이라고 앞쪽에 경련과 벌레의 수를 점수하는 것이 가장 좋은 방법입니다 우리가 &quot;토닉 - clonic&quot;이라고 BWM 마비와 앞쪽에 경련. 단일 유전자형 대부분의 벌레는 경련의 한 종류를 나타냅니다. 그러나, 토닉 - clonic 벌레들은 종종 완전히 토닉되기 때문에 모든 벌레가 이미 경련을 출품 경우에도 한 30 분 지난 분석을 계속해야합니다. 또한, 일부 웜은 접시를 크롤 링을 시도할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 경우에는 실험자의 PTZ 플레이트 주변 팔미트산의 일관된 금액을 확산 수 있습니다. 우린 10 MG 팔미트산 / ML EtOH 25 μL를 확산. </li></ol> Aldicarb 및 PTZ 선정 C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 행동 응답 <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> 돌연변이 이름 </th><th> 시냅스 역할 </th><th> 약물없는 행동 </th><th> Aldicarb하는 행동 응답 (야생 형에 비해 N2) </th><th> PTZ하는 행동 응답 </th></tr><tr><td> 톰 - 1 (ok188) </td><td> 시냅스 전달을 억제 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 향상된 속도 </td><td> 야생 형에서 분간 </td></tr><tr><td> UNC - 43 (n498n1186) </td><td> 복잡한 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 향상된 속도 </td><td> 전신 경련 </td></tr><tr><td> UNC - 25 (e156) </td><td> GABA 전송을 촉진 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 향상된 속도 </td><td> 앞쪽에 경련, 전신 마비 </td></tr><tr><td> snb - 1 (md247) </td><td> 시냅스 전송을 추진 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 감소 속도 </td><td> 앞쪽에 경련 </td></tr><tr><td> UNC - 4 (e120) </td><td> ACH 전송을 추진 </td><td> uncoordinated </td><td> 마비의 감소 속도 </td><td> 야생 형에서 분간 </td></tr></tbody></table> pentylenetetrazole (PTZ)라는 두 개의 신경 자극, aldicarb라는 acetylcholinesterase 억제제, 그리고 GABA 수용체 길항제는, C. 엘레간스 시냅스 전송 돌연변이를 특성화 보완 방식으로 사용할 수 있습니다. 초과 흥분성의 아세틸콜린 (ACH)는 ACH 전송의 부정적인 규제에 해로운 돌연변이에서 웜 몸을 벽 신경근육학 분기점 (NMJs)에 축적 (예 : 톰 - 1과 UNC - 43) 또는 억제 GABA 전송 (예, UNC - 25)의 긍정적인 규제. 반대로, 웜 NMJs에서 흥분성의 ACH 수준은 일반적인 시냅스 전송 (예 : snb - 1) 또는 ACH 특정 전송 유전자 (예 : UNC - 4)의 긍정적인 규제에 해로운 돌연변이에 의해 감소​​됩니다. 인하 흥분성의 ACH 전송과 돌연변이 웜은 aldicarb 유발 마비의 감소 속도를 보여주는 반면에 야생 형 N2 벌레에 비해, NMJs에서 고가 흥분성의 ACH 전송과 돌연변이 벌레는 aldicarb 유발 마비의 향상된 속도를 나타냅니다. PTZ가 aldicarb 달리 C. 엘레간스 신체 벽 근육에의 연결을 synchrony하지 방해 있지만, PTZ는 C. 엘레간스 헤드 근육에서 억제 GABA를 antagonizes. 결과적으로, aldicarb 감도 정확하게 PTZ 민감도를 예측할 수 없습니다. 부정적 또는 긍정적인 regul의 특정 결함 돌연변이 웜ACH 전송 에이션은 PTZ의 존재에 야생 형 N2 벌레에서 구별할 수 있으며, 억제 GABA 전송 전시 강력한 PTZ - 유발 앞쪽에 경련 일반적으로 시냅스 전송 또는 특정 결함 긍정적인 규정에 결함 돌연변이 벌레 반면. 또한, UNC - 43 손실 기능 돌연변이 PTZ의 존재에 전신 경련을 표시하고 가능성이 독특한 약물 반응에 기여하는 추가적인 시냅스 전달 이상을 보유하고 있습니다.

<ol><li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li>
<li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet.%22%5BJournal%5D)">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li>
</ol>

C.와 aldicarb 노출에 대한 현재 프로토콜 엘레간스는 돌연변이의 두 클래스가 aldicarb에 대한 저항력을 전시 같은 경험은 시냅스 전달의 일반적인 적자와 ACH 전송 및 돌연변이의 구체적인 결손과 돌연변이 사이의 구분을 허용하지 않습니다. 마찬가지로, aldicarb는 돌연변이의 두 클래스가 aldicarb에 과민성을 전시 등 돌연변이 부정적인 ACH 전송을 규제하는 GABA 전송 또는 일반 장애에서 특정 적자가 있는지 확인하는 데 사용할 수 없습니다. 우리 PTZ 노출 assays, aldicarb 노출 assays의 결과와 함께,에서 결과는 연구자 더 신경 전달 돌연변이를 특성을 수 있습니다. C. 엘레간스 시냅스 전송 돌연변이 보완 aldicarb 및 PTZ 노출 패러다임에 의해 직접적인 방식으로 분류됩니다. PTZ 유도 앞쪽에 경련과 Aldicarb 방지 돌연변이 일반적인 시냅스 기능에 가능성이 부족한 있습니다. 반대로, PTZ - 유발 앞쪽에 경련없이 aldicarb 방지 돌연변이 ...

<table><tbody><tr><td>Aldicarb</td><td>시약</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>PS734</td><td>Sigma에서 구매 가능</td></tr><tr><td>Pentylenetetrazole</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr></tbody></table>

c. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

선충류, Caenorhabditis의 엘레간스는 neurotransmission 공부를위한 편법 모델이되었다. 의 신경 계통의 해부와 연결이 전자 micrographs의 결정 및 약리 assays에 의해 정제되어로서 C. 엘레간스은 동물 모델 중 유일하다. 이 비디오에서는, 우리는 특별히 C. 엘레간스 신경근육학 분기점에서 신호 특성화 pentylenetetrazole (PTZ)라는 두 개의 상호 보완적인 신경 자극, aldicarb라는 acetylcholinesterase 억제제, 그리고 감마 aminobutyric 산 (GABA) 수용체 길항제가, 직업을 가지고있을 방법에 대해 설명합니다 (NMJs)과 대립 신경 회로의 우리의 이해를 용이하게합니다. 302 C. 엘레간스 뉴런, 열아홉 GABAergic D - 타입 모터 뉴런 신경을 분포시키다 바디 벽의 근육 (BWMs)의 동안 RMEs라는 네 GABAergic 뉴런, 신경을 분포시키다 머리 근육. 반대로, 서른아홉 모터 신경은 아세틸콜린을 흥분성의 신경 전달 물질을 표현 (ACH), 그리고 운동을 조정할 수 BWMs에서 GABA 전송을 반대. 바디 벽 NMJs에서 GABAergic 및 cholinergic 모터 뉴런의 대립 자연을 처음 레이저 절제에 의해 결정하고 나중에 aldicarb 노출에 의해 buttressed했다. 야생 형 웜의 시간 코스 또는 선량 - 반응 마비의 급성 aldicarb 노출 결과. 적은 ACH가 웜 NMJs에 축적으로하지만, 흥분성의 ACH 전송의 손실이 BWMs 적은 자극에 이르는, aldicarb에 대한 저항력을 수여. aldicarb에 저항이 ACH 특정 또는 일반 시냅스 기능 돌연변이로 관찰 수 있습니다. 대립 GABA와 ACH 전송, GABA 전송의 손실, 또는 부정적인 ACH 릴리스를 조절 실패와 일치, aldicarb에 과민성을 수여. aldicarb 노출이 neurotransmission의 유전자 수많은 웜 homologs의 고립을 주도하고 있지만, aldicarb 노출 혼자 효율적으로 특정 C. 엘레간스 모터 뉴런의 유전자 및 경로에 대한 일반적인 역할을 확인할 수 없습니다. 이러한 목적을 위해, 우리는 PTZ를 사용하는 보완 실험 방법을 도입했습니다. Neurotransmission의 돌연변이 PTZ에 대한 응답으로 aldicarb 유발 마비와는 분명 phenotypes을, 표시됩니다. 야생 형 웜뿐만 아니라, ACH를 해제받을 특정 inabilities과 돌연변이, PTZ에 명백한 감도를 표시하지 않습니다. 그러나, GABA의 돌연변이뿐만 아니라, 일반적인 신경 기능 돌연변이 시간 코스 또는 선량 - 반응 방식으로 앞쪽에 경련을 표시합니다. 부정적인 일반적인 신경 전달 물질 방출을 규제하고, 따라서 수없는 돌연변이 PTZ에 마비되고, BWMs에 ACH의 과도한 금액을 분비. 이산 돌연변이 클래스의 PTZ - 유발 phenotypes는 aldicarb과 C. 엘레간스에서 PTZ 노출 패러다임과 상호 보완적인 접근 방식이 neurotransmission 우리의 이해를 촉진 수 있음을 나타냅니다. 또한, 우리는 약리 assays을 수행하는 방법을 보여주는 동영상은 C. 엘레간스 연구 일관된 방법을 확립해야합니다.

이 동영상은 선충류, C. 엘레간스의 신경 기능을 연구 보완 방법의 두 신경 자극, aldicarb 및 pentylenetetrazole (PTZ)을 고용하는 방법을 보여줍니다. 이 상호 보완적인 접근 방법은 또한 modulating의 연결 synchrony에 대한 evolutionarily 보존 메커니즘에 대해 설명해 주실 사용 간질과 발작에 대한 의미를 가지고있을 수 있습니다.

C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

선충인 Caenorhabditis elegans는 신경전달을 연구하는 데 있어 효율적인 모델이 되었습니다. C. elegans는 동물 모델 중에서도 독특한데, 이는 ...

안녕하세요, 저는 앨라배마 대학교 생물과학과 Caldwell 연구실의 Cody Locke입니다. 저는 Kyle Lee이며, outta carb 및 PTZ 노출 분석을 위한 벌레 준비 방법을 보여드리겠습니다. 저는 Bernard Tu이며, out carb 분석 수행 방법을 시연하겠습니다.저는 Kaylin Berry이며, C. elegans 영상 제작을 담당하고 있습니다. 이번 발표에서는 제가 내레이션을 맡아 PTZ 노출 분석법을 시연하겠습니다. 오늘 저와 동료들은 일련의 대표적인 돌연변이 균주를 사용하여 PTZ 및 Aldicarb 노출 후 간질 C. elegans 모델을 통해 시냅스 전달 돌연변이의 특성을 분석하는 방법을 보여드리겠습니다.그럼 시작하겠습니다. 오늘 Kyle Lee가 절차 첫째 날의 ALD carb 분석 준비 과정을 보여드리겠습니다. 둘째 날 ALD carb 분석을 위해 각 유전자형 및 각 반복 실험당 최소 30마리의 성체 초기 단계 웜을 확보하십시오.실험자는 먹이원으로 e coli OP 50이 도말된 살균제 없는 신선한 NGM 플레이트에 L4 단계의 벌레를 50마리 이상 선택하는 것이 가장 좋습니다. 일관되고 허용 가능한 온도에서 벌레를 12에서 24시간 동안 배양하십시오. 20 °C에서 22 °C가 가장 적당하며, 25 °C도 허용 가능합니다.둘째 날에 Al Decarb의 100 millimolar 스톡 용액과 70% ethanol을 조제하고, 적절한 양의 Al Decarb를 NGM 플레이트에 도포합니다. 당사는 7.5 milliliters의 NGM이 담긴 60 millimeter 비통기성 페트리 플레이트에 100 millimolar Al Decarb 37.5 microliters를 도포하여 0.5 millimolar Al Decarb를 일관되게 사용합니다. Al Decarb 플레이트를 상온에서 약 30분에서 60분 동안 건조시킵니다.플레이트가 건조된 후 뚜껑을 살짝 열 필요는 없습니다. 각 alde carb 플레이트 중앙에 일정한 부피의 e coli를 첨가하고 30분에서 60분 동안 추가로 건조시킵니다. 실온에서 일반적으로 25 µL의 e coli OP 50을 첨가합니다.이 정도 부피의 OP 50은 웜들이 과밀해지지 않으면서 플레이트 중앙의 작은 구역에 머물 수 있도록 충분한 크기의 먹이 lawn을 형성합니다. 먹이 lawn이 마르면 albacarb 분석을 진행하십시오. ALD carb 분석의 주관적인 특성으로 인해, 실험은 블라인드 방식으로 수행하는 것을 강력히 권장합니다.이를 위해 주 실험자의 동료가 분석할 웜이 포함된 원래의 플레이트에 라벨을 다시 붙이거나, 타이머를 시작하기 직전에 원래의 플레이트에서 웜을 cipher alde carb 플레이트로 옮길 수 있습니다. 플레이트 준비가 완료되면 분석을 진행하며, 먼저 마비된 웜의 수를 측정합니다.급성 알데히드 탈탄산 효소(al decarb) 유도 마비를 정의하는 데에는 두 가지 주요 접근 방식이 있습니다. 첫 번째 방식은 인두 펌핑의 중단으로 마비를 정의하는 것입니다. 이 비디오 노트에서는 화면 오른쪽에 있는 벌레 인두의 내강 내에 위치한 어두운 구조를 확인할 수 있습니다.이 구조는 그라인더(grinder)라고 불리며, 콜린성 메커니즘을 통해 리듬감 있게 수축합니다. 이 영상 속 벌레의 이동 속도는 Al Decarb 노출로 인해 매우 느려진 상태입니다. 하지만 이 벌레의 인두 그라인더는 여전히 명확하게 움직이고 있습니다.따라서, 이 벌레는 펌핑 중단 정의에 의해 마비된 것이 아닙니다. 이 영상에서 화면 오른쪽에 위치한 인두 분쇄기가 수축하지 않는 것을 통해, al Decarb 유도 마비의 작동 정의인 펌핑 중단 상태임을 확인할 수 있어야 합니다. 이 벌레는 마비된 것으로 판정해야 합니다.하지만 이전 비디오의 벌레와 마찬가지로, 이 벌레는 약간의 좌우 먹이 탐색 움직임을 보이고 있습니다. Al Decarb에 의해 운동 능력이 손상되었음에도 불구하고, 이러한 움직임 때문에 실험자는 전신 부동 및 촉각에 대한 무반응이라는 Al Decarb 유도 마비의 두 번째 정의 방식으로는 이 벌레를 마비 상태라고 판단할 수 없을 것입니다. Al Decarb 유도 마비를 정의하는 두 번째 방식은 백금선으로 각 벌레를 지속적으로 자극하여 반응 여부를 확인하는 것입니다.육안으로 신체 움직임을 감지할 수 없는 경우, 저희가 권장하는 방법은 30분마다 머리 쪽을 두 번, 꼬리 쪽을 두 번 찔러 총 3시간 동안 관찰하는 것입니다. 보시는 바와 같이, 이 영상 속의 벌레는 신체 움직임이 뚜렷하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 이 벌레는 찌르기 자극에 대해 꼬리를 명확하게 움직이며 반응하므로, 우리는 이 벌레를 마비 상태라고 하지 않습니다.al decarb 유도 마비의 두 번째 정의에 따르면, 이전 비디오의 벌레와 마찬가지로 이 벌레는 몸을 분명하게 움직이지 않으므로 자극 테스트가 필요합니다. 하지만 이전 비디오의 벌레와 달리, 이 벌레는 자극에 명확하게 반응하지 않습니다.따라서, 이 벌레는 알데카브(al decarb) 유도 마비의 두 번째 정의에 의해 마비된 것으로 간주됩니다. 알데카브에 의한 마비 여부의 차이가 미세할 수 있으나, 실험자는 벌레를 알데카브 플레이트에 옮긴 직후 알데카브에 노출된 다수의 대표 벌레들을 단순히 관찰함으로써 시냅스 전달의 실질적인 변화를 식별할 수 있어야 합니다. 야생형 벌레들은 여전히 이동 가능합니다.이 영상에서는 이전 영상의 야생형 벌레들이 Al Decarb에 1시간 동안 노출된 후의 모습을 볼 수 있습니다. 벌레들의 속도가 어느 정도 느려졌으나 여전히 분명하게 움직이고 있음에 주목하십시오.야생형 벌레와 달리, 이 영상의 tomasin one 돌연변이체는 1시간 노출 후 완전히 고정되거나 거의 움직이지 않습니다. 이 결과는 tomasin one 돌연변이체가 신경근 접합부에서 신경전달물질 방출을 음성적으로 조절하지 못해 과도한 acetylcholine을 분비한다는 점과 일치합니다. 신경근 접합부의 시냅스 틈새에 존재하는 과도한 acetylcholine과 acetylcholine 분해 억제가 결합되어 Bial Decarb는 tomasin one 돌연변이체를 과민하게 만듭니다. 여기서 보여주지는 않았지만, calcium cal Moulin dependent protein kinase two의 C elegance 오솔로그를 인코딩하는 on 43의 기능 상실 대립유전자를 이용한 alde carb 분석에서도 유사한 결과가 나타나는 것으로 추정됩니다. 이 영상은 억제성 GABA 작동성 전달이 결핍된 on 25 돌연변이체를 보여줍니다.alde carb에 1시간 동안 노출되었을 때, tomasin one 및 M 43 돌연변이체와 유사하게 이들 돌연변이체는 alde carb로 인해 유도된 유의미한 운동 기능 저하를 보였으며, 동일한 시간 동안 al Decarb에 노출된 야생형 벌레보다 더 큰 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 al Decarb 노출과 GABA성 전달 감소의 결합으로 인해 M 25 돌연변이체의 체벽 근육이 과자극되어, CL ELs 신경근 접합부에서 흥분성 대 억제성 전달 비율이 높아지고 결과적으로 마비가 일어났다는 점과 일치합니다. 하지만 tomasin one, on 43 및 on 25 돌연변이체는 이 시점에서 Al Decarb에 대해 유사한 민감성을 나타냅니다.체벽 근육의 과도한 자극을 유발하는 원인이 서로 다를지라도, 실험자는 원인 돌연변이의 정체를 먼저 파악하지 않고서는 과민 반응의 기저 메커니즘을 알 수 없습니다. 본 영상에서는 이전 영상에서 사용했던 것과 동일한 야생형 벌레를 대상으로 하며, ALD carb 분석의 최종 시점인 3시간 노출 후의 상태를 확인합니다. 이때 야생형임에도 불구하고 이 벌레들이 완전히 부동 상태이거나 거의 움직이지 않는 것을 분명히 확인할 수 있습니다. 이 벌레들은 현재 ALD carb 노출 1시간 후의 TOM-1 및 M25 돌연변이체와 표현형적으로 유사한데, 이는 아마도 흥분성 콜린성 신경전달이 그와 유사한 수준에 도달했기 때문일 것입니다. 이와 대조적으로 Synap Bren-1 돌연변이체는 ALD carb에 3시간 동안 노출된 후에도 상당한 운동성을 유지합니다.이 결과는 정상적인 수준의 신경전달물질 분비가 결핍된 Synaptive Bren one 돌연변이체가 동일한 수준의 alde carb 노출 후 야생형 벌레보다 체벽 근육에서 콜린성 자극이 더 적다는 점과 일치합니다. 콜린성 전달이 특이적으로 결핍된 Point on four 돌연변이체는 Synaptive Bren one 돌연변이체와 유사한 Al Decarb 민감도를 보일 것입니다. 반대로, Tomasin one 및 O 25 과민성 돌연변이체는 야생형 벌레와 마찬가지로 마비 상태를 유지합니다.일부 벌레, 특히 Al Decarb에 저항성이 있는 벌레들은 플레이트 밖으로 기어나가려 할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 경우, 실험자는 벌레의 이동을 막는 물리적 장벽인 팔미틱산을 일정량 도포할 수 있습니다. Al Decarb 플레이트 주변에 10 mg/mL 농도의 에탄올에 용해된 팔미틱산 25 µL를 도포합니다.이것으로 Al Decarb 노출 패러다임을 마칩니다. 이제 Penta Lean Terazol 노출 패러다임을 시연하겠습니다. Kaylin Berry가 PTZ 분석을 도와줄 것입니다.PTZ 분석을 위한 벌레 준비 과정은 기본적으로 알데하이드 카바(alde carb) 분석을 위한 벌레 준비 과정과 동일합니다. 두 분석법의 유일하고 중요한 차이점은 다음과 같습니다. 70% ethanol 대신 DDH two O를 PTZ 용매로 사용합니다.또한, PTZ를 ALDE carb보다 더 많은 양으로 도말하는 경우가 많으므로, OP 50을 접종하기 전에 플레이트를 최소 1시간 동안 건조시킵니다. Palmitic acid 또한 PTZ와 함께 사용할 수 있습니다. 아울러, PTZ는 alde carb보다 훨씬 불안정하므로 반드시 -20°C에서 보관해야 한다는 점에 유의하십시오.분석을 시작하려면 30분 간격으로 1시간 동안 간질성 경련을 일으키는 벌레의 수를 측정하십시오. 전신 경련, 머리 흔들림(head Bobs)이라 칭하는 전방 경련, 전방 경련과 체벽 근육 마비가 동반되어 강직-간대성(tonic-clonic)이라 칭하는 상태, 또는 전신 마비로 인해 강직성(tonic)이라 칭하는 상태와 같이 서로 다른 유형의 경련을 보이는 벌레의 수를 별도의 범주로 나누어 기록하는 것이 좋습니다. 오른쪽 벌레에서 보이는 것과 같은 발작 유사 활동은 종종 왼쪽 벌레에서 보이는 강직-간대성 경련 이후에 나타납니다.발작과 유사한 활동은 반복적인 강직-간대성 경련 이후의 근육 피로로 인해 단순히 발생할 수 있습니다. 하지만 당사의 미발표 데이터에 따르면, 일부 벌레들은 이전에 강직-간대성 상태가 아니었음에도 불구하고 al decarb 유도 마비와 유사한 방식으로 PTZ에 의해 강직 상태가 될 수 있음을 보여줍니다. 여기서는 PTZ(GABA 수용체 길항제이자 다양한 발작 및 뇌전증 동물 모델에서 흔히 사용되는 발작 유도제)가 없는 상태에서 기어가는 대표적인 시냅스 전달 돌연변이 벌레를 보여줍니다.먹이 활동을 하는 동안 벌레의 끝부분이나 코 부분이 좌우로 흔들리는 것에 주목하십시오. 이 영상에서는 이전 영상에서 사용된 것과 동일한 시냅스 전달 돌연변이 균주의 다른 벌레를 보여줍니다. 1mL의 물당 2.5mg의 PTZ가 존재하는 환경에 있는 이 벌레가 먹이 활동을 하는 동안 주로 머리를 좌우로 계속 움직이는 것을 확인할 수 있습니다.하지만 이 벌레는 때때로 좌우로 먹이를 찾는 행동을 멈추고, 대신 전단부를 앞으로 반복적으로 찌릅니다. 마지막으로, 앞선 두 영상의 벌레들과 동일한 돌연변이를 가진 벌레를 ml당 10 mg의 PTZ가 포함된 물 조건에서 관찰해야 합니다. 이 벌레는 좌우로 먹이를 찾는 행동이 감소했으며, 더 낮은 농도의 PTZ일 때보다 더 높은 빈도와 강도로 전단부를 앞으로 찌르고 있음을 알 수 있습니다.이러한 결과는 모든 PTZ 민감성 시냅스 전달 돌연변이체에서 관찰되는 PTZ의 용량 의존성을 입증합니다. 중요한 점은, 야생형 벌레의 경우 PTZ 노출만으로는 간질 유사 경련을 유도하기에 충분하지 않다는 것입니다. 마찬가지로, on four와 같이 콜린성 전달에 특정한 결함이 있는 벌레나 tomasin one과 같이 콜린성 전달이 과도한 벌레에서도 PTZ로 유도된 간질 유사 경련을 시도하였으나 관찰되지 않았습니다.따라서 PTZ에 대한 상대적 민감도를 기반으로, 알데히드 카브(alde carb) 저항성을 가진 시냅스 전달 돌연변이체를 일반적인 시냅스 기능 결핍 또는 콜린성 전달의 특이적 결핍으로 추가 구분하는 것이 가능할 것입니다. 아마도 놀랍게도, C. elegans의 억제성 운동 신경세포에서 GABA 발현이 검출되지 않는 기능이 강력하게 감소된 ONC 25 돌연변이체는 이 비디오에서 보이는 것과 같은 자발적인 뇌전증성 경련을 나타내지 않습니다.물 1mL당 10mg의 PTZ를 처리한 ONC 25 돌연변이체는 강한 강직-간대성 경련을 보입니다. 다만, ONC 25와 관련된 강직-간대성 경련 이전에 일부 움직임이 동반된 전방부 전용 경련이 나타났으며(영상에는 표시되지 않음), 이는 synap Bren 1 돌연변이체의 경련과 유사했습니다. 따라서 실험자는 특히 저형질(hypomorphic) 돌연변이 대립유전자를 얻을 가능성을 고려하여, 모든 억제성 GABA 돌연변이체가 PTZ 존재 하에서 강직-간대성 경련이나 이와 밀접하게 연관된 강직성 발작 유사 활동을 보일 것이라고 가정해서는 안 됩니다.억제성 GABA 변이체는 Aldecarb와 PTZ 모두에 대해 과민성을 보였으나, 콜린성 전달의 음성 조절이 결핍된 변이체는 Aldecarb에 대해서만 과민성을 보이고 PTZ에 대해서는 정상적인 민감도를 보임을 확인했습니다. 다른 시냅스 전달 변이체들과 마찬가지로 Aldecarb에 과민하기 때문에, UNC-43 기능 상실 변이체가 PTZ에 대해 어떤 반응을 보일지 궁금할 수 있습니다. UNC-43 변이체는 PTZ가 없는 상태에서는 명백한 뇌전증 유사 경련을 나타내지는 않지만, 드물게 비반복적이지만 여전히 자발적인 전신 수축을 보입니다. 그러나 10 mg/mL PTZ 수용액에 노출된 후, UNC-43 기능 상실 변이체는 강렬하고 반복적이며 농도 의존적인 전신 경련을 나타냅니다. 현재로서 이러한 결과는 모호하지만, UNC-43이 억제성 GABA성 전달에서 특정한 역할을 하지는 않거나, 신경전달물질 방출의 음성 조절에서만 역할을 한다는 것을 시사하는 것으로 보입니다.*C. elegans* 신경계에서, 저희는 상보적인 신경 자극제인 콜린에스테라아제 억제제 Aldicarb와 GABA 수용체 길항제 PTZ를 사용하여 *C. elegans* 시냅스 전달 돌연변이체를 특성화하는 방법을 보여드렸습니다. 상보적인 약리학적 패러다임을 따를 때, 한 가지 신경 자극제에 대한 민감도가 다른 신경 자극제에 대한 민감도를 예측할 수 없음을 기억하십시오. Aldicarb 분석법을 활용하면, PTZ에 대해 head bobbing 반응을 보이지만 Aldicarb에는 과민 반응을 나타내는 억제성 GABA 돌연변이체와, 마찬가지로 PTZ에 대해 head bobbing 반응을 보이지만 Aldicarb에는 내성을 가진 일반적인 시냅스 기능 결핍 돌연변이체를 구별하는 데 도움이 됩니다. 또한, 억제성 GABA 돌연변이체는 PTZ에 대해 head bobbing 반응을 보이는 반면, 콜린성 전달의 음성 조절이 결여된 벌레는 PTZ에서 야생형과 동일하게 나타난다는 점을 인지해야 합니다.따라서 PTZ 분석법은 Alde carb에 모두 과민 반응하는 이러한 시냅스 전달 돌연변이 군들을 구분하는 데에도 활용될 수 있습니다. 요약하자면, PTZ와 Alde carb 분석법을 병행하는 보완적 접근 방식을 통해, 실험자는 어느 한 가지 약물만으로는 불가능한 방식으로 C elegant 시냅스 전달 돌연변이의 특성을 규명할 수 있을 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

접근 시냅스에 전기 생리학의 응용 프로그램 시냅스 돌연변이를 분석에 유용 시냅스 활동의 같지는 조치를 제공합니다. 이 문서 신경근육학 분기점 (NMJ)의 노출하는 데 사용되는 절개 방법을...

해부 및 C. 엘레간스 신경근육학 융티온에서 레코딩

Neurexins 및 neuroligins는 시냅스 차별화 및 전송에 필수적인 역할을 수행하는 막 - 신경 세포의 접착 단백질입니다. 의 Neuroligin 부족한...

의 삼투 회피 Caenorhabditis 엘레간스 : 두 유전자의 시냅틱 기능, 인간의 Orthologues NRXN1과 NLGN1</em자폐증을위한>로 후보

Microarray 분석은 유전자 표현의 프로필을 결정하기 위해...

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를...

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

dsRNA에는 C.에 공급하면서 엘레 대규모 공급 화면 현재 프로토콜이 변수 최저 효율 결과 유전자 기능을 평가하는 강력한 도구입니다. 우리는 유전자 발현의 높은 효능 및 재현성 넉다운 결과 대규모의 RNAi 수유 화면을 수행하기위한 개선 된 프로토콜을 설명한다.

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; C. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

예쁜 꼬마 선충에서 항 정신병 약물 (APDS)의 효과를 테스트하기위한 접근 방법을 설명합니다. 분석법 개발과 생존에와 인두 펌핑 속도에 약물 효과를 테스트하기 위해 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 APDS 이외의 다른 약 종류와 약물 유전 학적 실험에 적용 할 수 있습니다.

에서 항 정신병 약물의 작용 메커니즘을 공부하는 방법<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

이 프로토콜 꼬마 선 충 벌레 행동에 신경 활동에 기록 변화 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자의 사용을 설명 합니다.

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.

Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사

수영 유도 마비 (SWIP)가 잘 설립 행동 분석 결과 꼬마 선 충 (C. 선 충)에서 신호 하는 도파민의 기본 메커니즘을 연구 하는 데 사용. 그러나, 분석 결과 수행 하는 자세한 방법을 부족 이다. 여기, 우리가 SWIP에 대 한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

꼬마 선 충 에서 도파민 신호 평가에 수영 유도 마비

본 프로토콜은 예쁜 꼬마선충 아세틸콜린 수용체의 한 부류의 약리학적 작용제인 레바미솔에 대한 반응을 결정하기 위한 검정을 기술한다. 이 액체 레바미솔 수영 분석에서 연구자들은 24 웰 플레이트에서 재배 된 동물의 시간 의존적 마비를 시각적으로 관찰하고 정량화합니다.

Caenorhabditis elegans 아세틸콜린 수용체 작용제 Levamisol에 대한 민감도 측정

학습하세요 C. elegans를 이용한 시냅스 전송 돌연변이의 약리학적 특성 분석 방법을. 알디카브와 PTZ를 활용한 이 기법은 신경과학 및 간질 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

더 많은 동영상 탐색