C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

안녕하세요, 저는 앨라배마 대학교 생물과학과 Caldwell 연구실의 Cody Locke입니다. 저는 Kyle Lee이며, outta carb 및 PTZ 노출 분석을 위한 벌레 준비 방법을 보여드리겠습니다. 저는 Bernard Tu이며, out carb 분석 수행 방법을 시연하겠습니다.

저는 Kaylin Berry이며, C. elegans 영상 제작을 담당하고 있습니다. 이번 발표에서는 제가 내레이션을 맡아 PTZ 노출 분석법을 시연하겠습니다. 오늘 저와 동료들은 일련의 대표적인 돌연변이 균주를 사용하여 PTZ 및 Aldicarb 노출 후 간질 C. elegans 모델을 통해 시냅스 전달 돌연변이의 특성을 분석하는 방법을 보여드리겠습니다.

그럼 시작하겠습니다. 오늘 Kyle Lee가 절차 첫째 날의 ALD carb 분석 준비 과정을 보여드리겠습니다. 둘째 날 ALD carb 분석을 위해 각 유전자형 및 각 반복 실험당 최소 30마리의 성체 초기 단계 웜을 확보하십시오.

실험자는 먹이원으로 e coli OP 50이 도말된 살균제 없는 신선한 NGM 플레이트에 L4 단계의 벌레를 50마리 이상 선택하는 것이 가장 좋습니다. 일관되고 허용 가능한 온도에서 벌레를 12에서 24시간 동안 배양하십시오. 20 °C에서 22 °C가 가장 적당하며, 25 °C도 허용 가능합니다.

둘째 날에 Al Decarb의 100 millimolar 스톡 용액과 70% ethanol을 조제하고, 적절한 양의 Al Decarb를 NGM 플레이트에 도포합니다. 당사는 7.5 milliliters의 NGM이 담긴 60 millimeter 비통기성 페트리 플레이트에 100 millimolar Al Decarb 37.5 microliters를 도포하여 0.5 millimolar Al Decarb를 일관되게 사용합니다. Al Decarb 플레이트를 상온에서 약 30분에서 60분 동안 건조시킵니다.

플레이트가 건조된 후 뚜껑을 살짝 열 필요는 없습니다. 각 alde carb 플레이트 중앙에 일정한 부피의 e coli를 첨가하고 30분에서 60분 동안 추가로 건조시킵니다. 실온에서 일반적으로 25 µL의 e coli OP 50을 첨가합니다.

이 정도 부피의 OP 50은 웜들이 과밀해지지 않으면서 플레이트 중앙의 작은 구역에 머물 수 있도록 충분한 크기의 먹이 lawn을 형성합니다. 먹이 lawn이 마르면 albacarb 분석을 진행하십시오. ALD carb 분석의 주관적인 특성으로 인해, 실험은 블라인드 방식으로 수행하는 것을 강력히 권장합니다.

이를 위해 주 실험자의 동료가 분석할 웜이 포함된 원래의 플레이트에 라벨을 다시 붙이거나, 타이머를 시작하기 직전에 원래의 플레이트에서 웜을 cipher alde carb 플레이트로 옮길 수 있습니다. 플레이트 준비가 완료되면 분석을 진행하며, 먼저 마비된 웜의 수를 측정합니다.

급성 알데히드 탈탄산 효소(al decarb) 유도 마비를 정의하는 데에는 두 가지 주요 접근 방식이 있습니다. 첫 번째 방식은 인두 펌핑의 중단으로 마비를 정의하는 것입니다. 이 비디오 노트에서는 화면 오른쪽에 있는 벌레 인두의 내강 내에 위치한 어두운 구조를 확인할 수 있습니다.

이 구조는 그라인더(grinder)라고 불리며, 콜린성 메커니즘을 통해 리듬감 있게 수축합니다. 이 영상 속 벌레의 이동 속도는 Al Decarb 노출로 인해 매우 느려진 상태입니다. 하지만 이 벌레의 인두 그라인더는 여전히 명확하게 움직이고 있습니다.

따라서, 이 벌레는 펌핑 중단 정의에 의해 마비된 것이 아닙니다. 이 영상에서 화면 오른쪽에 위치한 인두 분쇄기가 수축하지 않는 것을 통해, al Decarb 유도 마비의 작동 정의인 펌핑 중단 상태임을 확인할 수 있어야 합니다. 이 벌레는 마비된 것으로 판정해야 합니다.

하지만 이전 비디오의 벌레와 마찬가지로, 이 벌레는 약간의 좌우 먹이 탐색 움직임을 보이고 있습니다. Al Decarb에 의해 운동 능력이 손상되었음에도 불구하고, 이러한 움직임 때문에 실험자는 전신 부동 및 촉각에 대한 무반응이라는 Al Decarb 유도 마비의 두 번째 정의 방식으로는 이 벌레를 마비 상태라고 판단할 수 없을 것입니다. Al Decarb 유도 마비를 정의하는 두 번째 방식은 백금선으로 각 벌레를 지속적으로 자극하여 반응 여부를 확인하는 것입니다.

육안으로 신체 움직임을 감지할 수 없는 경우, 저희가 권장하는 방법은 30분마다 머리 쪽을 두 번, 꼬리 쪽을 두 번 찔러 총 3시간 동안 관찰하는 것입니다. 보시는 바와 같이, 이 영상 속의 벌레는 신체 움직임이 뚜렷하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 이 벌레는 찌르기 자극에 대해 꼬리를 명확하게 움직이며 반응하므로, 우리는 이 벌레를 마비 상태라고 하지 않습니다.

al decarb 유도 마비의 두 번째 정의에 따르면, 이전 비디오의 벌레와 마찬가지로 이 벌레는 몸을 분명하게 움직이지 않으므로 자극 테스트가 필요합니다. 하지만 이전 비디오의 벌레와 달리, 이 벌레는 자극에 명확하게 반응하지 않습니다.

따라서, 이 벌레는 알데카브(al decarb) 유도 마비의 두 번째 정의에 의해 마비된 것으로 간주됩니다. 알데카브에 의한 마비 여부의 차이가 미세할 수 있으나, 실험자는 벌레를 알데카브 플레이트에 옮긴 직후 알데카브에 노출된 다수의 대표 벌레들을 단순히 관찰함으로써 시냅스 전달의 실질적인 변화를 식별할 수 있어야 합니다. 야생형 벌레들은 여전히 이동 가능합니다.

이 영상에서는 이전 영상의 야생형 벌레들이 Al Decarb에 1시간 동안 노출된 후의 모습을 볼 수 있습니다. 벌레들의 속도가 어느 정도 느려졌으나 여전히 분명하게 움직이고 있음에 주목하십시오.

야생형 벌레와 달리, 이 영상의 tomasin one 돌연변이체는 1시간 노출 후 완전히 고정되거나 거의 움직이지 않습니다. 이 결과는 tomasin one 돌연변이체가 신경근 접합부에서 신경전달물질 방출을 음성적으로 조절하지 못해 과도한 acetylcholine을 분비한다는 점과 일치합니다. 신경근 접합부의 시냅스 틈새에 존재하는 과도한 acetylcholine과 acetylcholine 분해 억제가 결합되어 Bial Decarb는 tomasin one 돌연변이체를 과민하게 만듭니다. 여기서 보여주지는 않았지만, calcium cal Moulin dependent protein kinase two의 C elegance 오솔로그를 인코딩하는 on 43의 기능 상실 대립유전자를 이용한 alde carb 분석에서도 유사한 결과가 나타나는 것으로 추정됩니다. 이 영상은 억제성 GABA 작동성 전달이 결핍된 on 25 돌연변이체를 보여줍니다.

alde carb에 1시간 동안 노출되었을 때, tomasin one 및 M 43 돌연변이체와 유사하게 이들 돌연변이체는 alde carb로 인해 유도된 유의미한 운동 기능 저하를 보였으며, 동일한 시간 동안 al Decarb에 노출된 야생형 벌레보다 더 큰 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 al Decarb 노출과 GABA성 전달 감소의 결합으로 인해 M 25 돌연변이체의 체벽 근육이 과자극되어, CL ELs 신경근 접합부에서 흥분성 대 억제성 전달 비율이 높아지고 결과적으로 마비가 일어났다는 점과 일치합니다. 하지만 tomasin one, on 43 및 on 25 돌연변이체는 이 시점에서 Al Decarb에 대해 유사한 민감성을 나타냅니다.

체벽 근육의 과도한 자극을 유발하는 원인이 서로 다를지라도, 실험자는 원인 돌연변이의 정체를 먼저 파악하지 않고서는 과민 반응의 기저 메커니즘을 알 수 없습니다. 본 영상에서는 이전 영상에서 사용했던 것과 동일한 야생형 벌레를 대상으로 하며, ALD carb 분석의 최종 시점인 3시간 노출 후의 상태를 확인합니다. 이때 야생형임에도 불구하고 이 벌레들이 완전히 부동 상태이거나 거의 움직이지 않는 것을 분명히 확인할 수 있습니다. 이 벌레들은 현재 ALD carb 노출 1시간 후의 TOM-1 및 M25 돌연변이체와 표현형적으로 유사한데, 이는 아마도 흥분성 콜린성 신경전달이 그와 유사한 수준에 도달했기 때문일 것입니다. 이와 대조적으로 Synap Bren-1 돌연변이체는 ALD carb에 3시간 동안 노출된 후에도 상당한 운동성을 유지합니다.

이 결과는 정상적인 수준의 신경전달물질 분비가 결핍된 Synaptive Bren one 돌연변이체가 동일한 수준의 alde carb 노출 후 야생형 벌레보다 체벽 근육에서 콜린성 자극이 더 적다는 점과 일치합니다. 콜린성 전달이 특이적으로 결핍된 Point on four 돌연변이체는 Synaptive Bren one 돌연변이체와 유사한 Al Decarb 민감도를 보일 것입니다. 반대로, Tomasin one 및 O 25 과민성 돌연변이체는 야생형 벌레와 마찬가지로 마비 상태를 유지합니다.

일부 벌레, 특히 Al Decarb에 저항성이 있는 벌레들은 플레이트 밖으로 기어나가려 할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 경우, 실험자는 벌레의 이동을 막는 물리적 장벽인 팔미틱산을 일정량 도포할 수 있습니다. Al Decarb 플레이트 주변에 10 mg/mL 농도의 에탄올에 용해된 팔미틱산 25 µL를 도포합니다.

이것으로 Al Decarb 노출 패러다임을 마칩니다. 이제 Penta Lean Terazol 노출 패러다임을 시연하겠습니다. Kaylin Berry가 PTZ 분석을 도와줄 것입니다.

PTZ 분석을 위한 벌레 준비 과정은 기본적으로 알데하이드 카바(alde carb) 분석을 위한 벌레 준비 과정과 동일합니다. 두 분석법의 유일하고 중요한 차이점은 다음과 같습니다. 70% ethanol 대신 DDH two O를 PTZ 용매로 사용합니다.

또한, PTZ를 ALDE carb보다 더 많은 양으로 도말하는 경우가 많으므로, OP 50을 접종하기 전에 플레이트를 최소 1시간 동안 건조시킵니다. Palmitic acid 또한 PTZ와 함께 사용할 수 있습니다. 아울러, PTZ는 alde carb보다 훨씬 불안정하므로 반드시 -20°C에서 보관해야 한다는 점에 유의하십시오.

분석을 시작하려면 30분 간격으로 1시간 동안 간질성 경련을 일으키는 벌레의 수를 측정하십시오. 전신 경련, 머리 흔들림(head Bobs)이라 칭하는 전방 경련, 전방 경련과 체벽 근육 마비가 동반되어 강직-간대성(tonic-clonic)이라 칭하는 상태, 또는 전신 마비로 인해 강직성(tonic)이라 칭하는 상태와 같이 서로 다른 유형의 경련을 보이는 벌레의 수를 별도의 범주로 나누어 기록하는 것이 좋습니다. 오른쪽 벌레에서 보이는 것과 같은 발작 유사 활동은 종종 왼쪽 벌레에서 보이는 강직-간대성 경련 이후에 나타납니다.

발작과 유사한 활동은 반복적인 강직-간대성 경련 이후의 근육 피로로 인해 단순히 발생할 수 있습니다. 하지만 당사의 미발표 데이터에 따르면, 일부 벌레들은 이전에 강직-간대성 상태가 아니었음에도 불구하고 al decarb 유도 마비와 유사한 방식으로 PTZ에 의해 강직 상태가 될 수 있음을 보여줍니다. 여기서는 PTZ(GABA 수용체 길항제이자 다양한 발작 및 뇌전증 동물 모델에서 흔히 사용되는 발작 유도제)가 없는 상태에서 기어가는 대표적인 시냅스 전달 돌연변이 벌레를 보여줍니다.

먹이 활동을 하는 동안 벌레의 끝부분이나 코 부분이 좌우로 흔들리는 것에 주목하십시오. 이 영상에서는 이전 영상에서 사용된 것과 동일한 시냅스 전달 돌연변이 균주의 다른 벌레를 보여줍니다. 1mL의 물당 2.5mg의 PTZ가 존재하는 환경에 있는 이 벌레가 먹이 활동을 하는 동안 주로 머리를 좌우로 계속 움직이는 것을 확인할 수 있습니다.

하지만 이 벌레는 때때로 좌우로 먹이를 찾는 행동을 멈추고, 대신 전단부를 앞으로 반복적으로 찌릅니다. 마지막으로, 앞선 두 영상의 벌레들과 동일한 돌연변이를 가진 벌레를 ml당 10 mg의 PTZ가 포함된 물 조건에서 관찰해야 합니다. 이 벌레는 좌우로 먹이를 찾는 행동이 감소했으며, 더 낮은 농도의 PTZ일 때보다 더 높은 빈도와 강도로 전단부를 앞으로 찌르고 있음을 알 수 있습니다.

이러한 결과는 모든 PTZ 민감성 시냅스 전달 돌연변이체에서 관찰되는 PTZ의 용량 의존성을 입증합니다. 중요한 점은, 야생형 벌레의 경우 PTZ 노출만으로는 간질 유사 경련을 유도하기에 충분하지 않다는 것입니다. 마찬가지로, on four와 같이 콜린성 전달에 특정한 결함이 있는 벌레나 tomasin one과 같이 콜린성 전달이 과도한 벌레에서도 PTZ로 유도된 간질 유사 경련을 시도하였으나 관찰되지 않았습니다.

따라서 PTZ에 대한 상대적 민감도를 기반으로, 알데히드 카브(alde carb) 저항성을 가진 시냅스 전달 돌연변이체를 일반적인 시냅스 기능 결핍 또는 콜린성 전달의 특이적 결핍으로 추가 구분하는 것이 가능할 것입니다. 아마도 놀랍게도, C. elegans의 억제성 운동 신경세포에서 GABA 발현이 검출되지 않는 기능이 강력하게 감소된 ONC 25 돌연변이체는 이 비디오에서 보이는 것과 같은 자발적인 뇌전증성 경련을 나타내지 않습니다.

물 1mL당 10mg의 PTZ를 처리한 ONC 25 돌연변이체는 강한 강직-간대성 경련을 보입니다. 다만, ONC 25와 관련된 강직-간대성 경련 이전에 일부 움직임이 동반된 전방부 전용 경련이 나타났으며(영상에는 표시되지 않음), 이는 synap Bren 1 돌연변이체의 경련과 유사했습니다. 따라서 실험자는 특히 저형질(hypomorphic) 돌연변이 대립유전자를 얻을 가능성을 고려하여, 모든 억제성 GABA 돌연변이체가 PTZ 존재 하에서 강직-간대성 경련이나 이와 밀접하게 연관된 강직성 발작 유사 활동을 보일 것이라고 가정해서는 안 됩니다.

억제성 GABA 변이체는 Aldecarb와 PTZ 모두에 대해 과민성을 보였으나, 콜린성 전달의 음성 조절이 결핍된 변이체는 Aldecarb에 대해서만 과민성을 보이고 PTZ에 대해서는 정상적인 민감도를 보임을 확인했습니다. 다른 시냅스 전달 변이체들과 마찬가지로 Aldecarb에 과민하기 때문에, UNC-43 기능 상실 변이체가 PTZ에 대해 어떤 반응을 보일지 궁금할 수 있습니다. UNC-43 변이체는 PTZ가 없는 상태에서는 명백한 뇌전증 유사 경련을 나타내지는 않지만, 드물게 비반복적이지만 여전히 자발적인 전신 수축을 보입니다. 그러나 10 mg/mL PTZ 수용액에 노출된 후, UNC-43 기능 상실 변이체는 강렬하고 반복적이며 농도 의존적인 전신 경련을 나타냅니다. 현재로서 이러한 결과는 모호하지만, UNC-43이 억제성 GABA성 전달에서 특정한 역할을 하지는 않거나, 신경전달물질 방출의 음성 조절에서만 역할을 한다는 것을 시사하는 것으로 보입니다.

*C. elegans* 신경계에서, 저희는 상보적인 신경 자극제인 콜린에스테라아제 억제제 Aldicarb와 GABA 수용체 길항제 PTZ를 사용하여 *C. elegans* 시냅스 전달 돌연변이체를 특성화하는 방법을 보여드렸습니다. 상보적인 약리학적 패러다임을 따를 때, 한 가지 신경 자극제에 대한 민감도가 다른 신경 자극제에 대한 민감도를 예측할 수 없음을 기억하십시오. Aldicarb 분석법을 활용하면, PTZ에 대해 head bobbing 반응을 보이지만 Aldicarb에는 과민 반응을 나타내는 억제성 GABA 돌연변이체와, 마찬가지로 PTZ에 대해 head bobbing 반응을 보이지만 Aldicarb에는 내성을 가진 일반적인 시냅스 기능 결핍 돌연변이체를 구별하는 데 도움이 됩니다. 또한, 억제성 GABA 돌연변이체는 PTZ에 대해 head bobbing 반응을 보이는 반면, 콜린성 전달의 음성 조절이 결여된 벌레는 PTZ에서 야생형과 동일하게 나타난다는 점을 인지해야 합니다.

따라서 PTZ 분석법은 Alde carb에 모두 과민 반응하는 이러한 시냅스 전달 돌연변이 군들을 구분하는 데에도 활용될 수 있습니다. 요약하자면, PTZ와 Alde carb 분석법을 병행하는 보완적 접근 방식을 통해, 실험자는 어느 한 가지 약물만으로는 불가능한 방식으로 C elegant 시냅스 전달 돌연변이의 특성을 규명할 수 있을 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.