Name: 세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 배우세요 세미 변성 세제 아가로오스 겔 전기영동(SDD-AGE)을 사용하여 아밀로이드 유사 중합체를 검출하고 특성화하는 방법을. 이 기술은 프리온 및 기타 집합체 형성 단백질을 선별하는 데 활용됩니다.

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우리는이 프로토콜을 개발과 지원 사이먼 Alberti 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (GM25874), 하워드 휴즈 의학 연구소 Investigatorship (SL)을, 그리고 국립 과학 재단 predoctoral 훈련 부여 (RH)을에서 교부금에 의해 지원되었다.

<html> 1 부 : 겔 준비 <ol><li> 겔 주조 트레이를 조립. 수평 DNA 전기 영동 표준 장비를 사용할 수 있습니다. 샘플 많은 경우, 우리는 최대 4 개의 50 - 잘 빗과 함께 X 24cm 슬래브 20cm를 준비합니다. 이들은 얼룩 이미지를 왜곡 수 슬래브가 흠집이없는 있는지 확인하십시오. </li><li> 1X 태의 1.5 % 아가로 오스 솔루션 (중간 또는 높은 겔 강도, 낮은 EEO)를 만듭니다. 볼륨 완전히 잠수함 빗 치아를 충분히해야합니다 - 당신은 검색을 최대화하기 위해 가능한 한 많은 예제를로드하는 것이 좋습니다. 마이크로 웨이브는 혼합물은 아가로 오스는 완전히 녹아 때까지. </li><li> 신속하게 10 %의 주식의 0.1 %에 SDS를 추가합니다. 섞어 소용돌이. 일부 아가로 오스는이 단계 동안 굳은 경우, 뜨거운 접시를 사용하여 redissolve하고 끓는 않도록주의하십시오. </li><li> 캐스팅 트레이에 솔루션을 하거라. 그들이 나중에 전송을 방해할 수있는 것처럼 언제 거품이 밖으로 경사각에 빗을 사용합니다. </li><li> 젤 설정한 후, 빗을 제거하고 겔 탱크에 젤 넣습니다. 완전 잠수함 1X 태에서 젤은 SDS 0.1 %를 포함. </li></ol> 2 부 : 준비 샘플 <ol><li> 효모 lysates의 높은 처리량 분석을 위해, 우리는 96 블록에 잘 급속한 동요와 하룻밤 성장 2 - ML 문화로 시작합니다. 이 경우, 각 문화는 overexpressing 관심의 단백질이다. 낮은 풍부한 단백질을 분석하면, 더 큰 문화 볼륨을 사용해야합니다 </li><li> 상온에서 5 분 2000 RCF에서 원심 분리하여 세포를 수확. </li><li> 다시 물, 원심 분리기에서 세포를 Resuspend. </li><li> 1 ML spheroplasting 솔루션 Resuspend. 30 약 30 분 품어 ° C (당신은 현미경으로 spheroplasting 효율성을 확인 수 있습니다.) </li><li> 상온에서 5 분 800 RCF에서 원심 분리기. 완전히 뜨는 제거합니다. </li><li> 100 ML의 용해 버퍼 pelleted spheroplasts을 Resuspend. </li><li> 테이프 2 분 고속에 소용돌이와 함께 블록을 커버. </li><li> 2 분 4,000 RCF에서 펠렛 셀룰러 잔해. </li><li> 조심스럽게 새로운 용기, 예를 들어, 96 - 웰 플레이트 PCR에 뜨는 제거합니다. </li><li> 원하는 경우, lysates의 단백질 농도를 결정한다. </li><li> 1X 샘플 버퍼를 포함하는 lysates를 생성하는 샘플에 4X 샘플 버퍼를 추가합니다. 상온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 젤을로드합니다. 원하는 경우, 샘플 볼륨의 절반을 저장하고 SDS - PAGE 분석을 위해 끓여. 나중에 양도의 범위를 모니터하기 위해, 사전에 묻은 SDS - PAGE 마커를 포함합니다. 또한, 매우 큰 단백질 (예, 닭고기 pectoralis 추출)로 구성된 분자량 마커가 해결 단지의 크기를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 염료 앞에는 젤의 끝에서 ~ 1cm에 도달할 때까지 저전압 (≤ 3 V / cm 겔 길이)에서 실행합니다. 이것은 몇 시간이 소요됩니다. 젤 시원한 유지하는 것이 중요합니다, 그렇지 않으면 낮은 분자량의 단백질 (예 : 단량체)의 확산들은 검색을 제한할 수 있습니다. </li></ol> 파트 3 : 전송 <ol><li> 젤 같은 크기로 nitrocellulose의 한 조각을 잘라 버릴거야. </li><li> 젤 같은 크기로 GB004 20 조각과 GB002 압지 8 조각을 잘라 버릴거야. 심지로 사용될 GB004의 추가 부분을 잘라, 겔보다 약 20 cm 폭을합니다. </li><li> 1X TBS에서 nitrocellulose, 심지, 그리고 GB002 4 조​​각을 담가. </li><li> 마른 GB004 20 조각, 다음 마른 GB002 4 조​​각, 다음 사전 서부 유럽 표준시 GB002 중 하나 조각 : 플라스틱 용기에, 다음과 같이 서류의 스택을 조립. 이 스택의 상단에있는 nitrocellulose 있다고 믿는다. </li><li> 초과 실행 버퍼를 제거하는 물에 캐스팅 트레이 간략에서 젤 린스. 그런 다음, 조심스럽게 스택에 트레이에서 젤 슬라이드 시작합니다. 트레이에서 젤 슬라이딩 있지만, 필요에 따라 TBS와 멤브레인을 줄여봐. 추가 버퍼 젤 아래에 갇혀되는 것을 거품을 방지하는 데 도움이됩니다. 전송 피펫이 목적을 위해 잘 작동합니다. </li><li> 젤이 스택으로 이동되었습니다 후, 거품에 대해 철저히 확인하십시오. 어떤이있는 경우, 젤의 가장자리를 채취해서 거품이 해낼 수있을 때까지 버퍼를 다시 적용합니다. </li><li> 젤 위에 나머지 세 미리 침수 GB002 조각을 넣어. 단단히 스택의 맨 위에 피펫 롤링하여 모든 레이어 간의 접촉을 철저히 보장합니다. </li><li> TBS 담긴 두개의 높은 쟁반과 플렝크 전송 스택을. 심지의 양쪽 끝에이 TBS에 빠져들 것입니다 이러한 스택에 걸쳐 사전 서부 유럽 표준시 심지를 드레이프. </li><li> 추가 무게를 (예, 물 500 ML 병) 베어링 추가 플라스틱 트레이로 조립 전송 스택을 커버. </li><li> 세 시간이나 밤새 최소 진행 전송을 허용합니다. </li><li> 전송 후, 멤브레인 표준 양식은 모래 바닥으로 처리할 수 있습니다. </li></ol> Spheroplasting 솔루션 1.2 M D - sorbitol 0.5 MM MgCl 2 20 MM 트리스, 산도 7.5 50 MM의 BME (신선 추가) 0.5 MG / ML Zymolyase 100T는 (신선한 추가) coration : 밑줄; &quot;&gt; 용해 완충액 100 MM 트리스 7.5 50 MM NaCl 10 MM BME는 (신선한 추가) 단백 분해 효소 억제제는 (신선한 추가) 4X 샘플 버퍼 2X 태 20 % 글리세롤 8퍼센트 SDS 취향에 bromophenol 블루

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
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<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
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</ol>

SDD - AGE 먼저 Kryndushkin 외 의해보고되었다. 1, SDS 방지 단지 공부를 [PSI +] 효모의 프리온, 이후 프리온이 아닌 프리온 집계 2-9 모두를 공부하고 널리 사용 발견했습니다. 그러나, 아가로 오스 겔에서 막 다음 전기 영동으로 단백질의 양도 문제이며, 왜곡된 얼룩 이미지 5 발생할 수 있습니다. 또한, 가장 일반적으로 사용하는 잠수 electroblotting 기술은 젤의 크기에 대한 실질적인 제한을 도입하기 때문에 처리할 수 샘플의 수입니다. 우리는 아래로 모세 전송 10, 겔에서 nitrocellulose 막에 단백질을 전송 마른 모래 바닥 논문의 스택을 사용하는 간단한 절차를 채용하여 이러한 문제를 해결했습니다. 모세관 전송 왜곡을 방지하고 대형 젤 쉽게 처리할 수 있습니다. SDD - AGE를 사용하기 전에 고려해야 할 몇 가지가 있습니다. 원유 샘플 (예 : lysates), 특정 단백질의 면역이 필요합니다. SDD - 나이가 충분히 관심의 단백질 단지를 변성하지 감지하는 단백질 (들)은 amyloidogenic 지역 이외의 에피토프 태그를 부담합니다 그럼. 그들이 정상적인 SDS - PAGE를위한 것입니다 같은 Lysates는 일반적으로 두 가지 중요한 차이점으로 준비하실 수 있습니다. 첫째, proteolysis에 의해 저하를 방지하기 위해 증가주의 이동합니다. 여기에 사용되는 부분 denaturing 조건은 프로 테아제를 inactivate에 충분하지 않은, 또한 proteolysis에 타겟 단백질이 더 취약 할 수 있습니다. 적어도 두 배 권장 농도에서 전체 테아제 억제제 칵테일을 사용합니다. 둘째, 샘플을 피해야한다 가열. 모든 단량체 음성 컨트롤이 필요한 경우, 예를 들어 높은 분자 - 중량 종은 monomeric 단백질 가장 amyloids를 복원하는 것입니다 공유 결합 수정, 95에서 10 분 배양 ° C를 사용할 수로 인해하지 않는지 확인합니다.

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Halt 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-C extra 니트로셀룰로오스</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>GB004 블로팅 페이퍼</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>GB002 (3MM Chr) 블로팅 페이퍼</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

세미 denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

아밀로이드 집계는 conformationally 아르 다수의 단백질의 misfolding pathologies과 underlies prions의 전염성 속성 자체 템플릿 낮은 생물에 유익한 역할을 할 생각되고 있습니다 단백질을.과 관련된 Amyloids들은 불용성 및 구조 이질에 의한 연구에 악명 어려운되었습니다. 그러나, 크기 및 세제 불용성을 바탕으로 아밀로이드 고분자의 해상도에 의해 가능하게되었습니다 세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 겔 전기 영동을 (SDD - AGE). 이 기술은 아밀로이드 conformational 변종의 검출 및 특성에 대한 광범위한 사용을 찾는 것입니다. 여기, 우리는 소설 prions 및 기타 amyloidogenic 단백질에 대한 화면으로 대규모 애플 리케이션에서의 사용을 용이하게이 기술의 적응을 보여줍니다. 새로운 SDD - AGE 방법은 더 큰 안정성을 위해 모세 전송을 사용하고 사용의 용이성, 그리고 모든 크기의 겔이 수용 수 있습니다. 따라서, 세포 또는 정제된 단백질에서 준비한 샘플 많은가, 태그 단백질의 SDS - 불용성 conformers의 존재를 동시에 처리할 수 있습니다.

SDD - 나이가 세포에서 고분자와 같은 아밀로이드의 감지 및 특성화를위한 유용한 기법입니다. 여기 우리는 대규모 응용 프로그램에이 기술을 의무하게 적응을 보여줍니다.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

아밀로이드 응집은 수많은 단백질 미스폴딩 병증과 관련이 있으며, ...인 프리온의 감염 특성의 기초가 됩니다.

안녕하세요, 저는 MIT 생물학과 Susan Linus 연구실의 대학원생 Randall Hoffman입니다. 오늘은 반변성 세제 아가로스 겔 전기영동, 즉 SDD-AGE에 대해 소개해 드리겠습니다. 저희 연구실에서는 프리온 및 기타 아밀로이드성 단백질을 스크리닝하기 위해 이 기술을 사용합니다.우리가 사용하는 SDD 연령 측정법은 간단하고 신뢰할 수 있으며, 어떤 수의 샘플이라도 처리할 수 있도록 확장 가능합니다. 아밀로이드(Amyloids)는 SDS에 의한 변성에 매우 강하며, 이를 통해 SDDH를 사용하여 다른 단백질과 분리할 수 있습니다. 하지만 SDDH 데이터만으로는 특정 물질이 아밀로이드라는 것을 확정할 수 없습니다.이를 위해서는 다른 기술을 사용해야 합니다. 그런 의미에서 제가 보여드리겠습니다. S-D-D-H-S-D-D-H는 수평 DNA 전기영동을 위한 표준 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다.먼저, 겔 캐스팅 트레이를 조립해야 합니다. 장치의 크기는 샘플 수에 따라 달라집니다. 샘플 수가 많을 경우 20 by 24 cm 슬랩과 최대 4개의 50 well 콤을 사용합니다.겔을 준비하려면 중간 또는 높은 겔 강도의 저 EEO agarose, 1X TAE 버퍼 및 10% SDS 스톡 용액이 필요합니다. 1.5% agarose 용액과 1X TAE를 조제하십시오. 최대한 많은 샘플을 로딩하고 검출을 극대화할 수 있도록 겔을 가능한 한 두껍게 만드는 것이 좋습니다. agarose가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 전자레인지로 가열하십시오.100 XSDS 스톡을 0.1%에 빠르게 첨가하고 소용돌이 모양으로 섞어줍니다. 이 단계에서 일부 시약이 응고되면 핫플레이트 위에서 녹이십시오. 이때 용액이 끓지 않도록 주의하십시오.SDS를 추가하면 용액에 거품이 쉽게 생겨 넘칠 수 있으므로, 용액이 아직 뜨거울 때 캐스팅 트레이에 붓습니다. 그 후 콤(comb)을 사용하여 이후 겔 전이 과정에서 방해가 될 수 있는 기포를 제거합니다. 겔이 완전히 식고 응고되면, 콤을 조심스럽게 제거하고 겔을 탱크에 넣습니다.겔을 0.1% SDS가 포함된 1X TAE 용액에 완전히 잠기게 합니다. 이제 샘플을 로딩할 준비가 되었습니다. SDDH에 사용되는 단백질 샘플은 두 가지 중요한 예외 사항을 제외하고는 SDS-PAGE와 동일한 방식으로 준비합니다.첫째, 응집체가 단백질 단량체로 변성될 수 있으므로 샘플을 가열하지 않도록 주의해야 합니다. 둘째, 단백질 분해를 방지하는 데 주의를 기울이십시오. 본 실험에 사용된 변성 조건으로는 모든 프로테아제를 불활성화하기에 충분하지 않으므로, 권장 농도의 최소 2배에 해당하는 완전 프로테아제 억제제 칵테일(complete protease inhibitor cocktail)을 사용할 것을 권장합니다.본 시연에서는 특정 표적 단백질이 과발현된 효모 세포의 용해물을 사용하겠습니다. 일반적으로 VWR에서 구입 가능한 96-웰 블록에서 2 mL의 배양액으로 하룻밤 동안 배양하지만, 발현량이 적은 단백질을 분석할 때는 더 많은 양의 배양액을 사용해야 합니다.배양액을 상온에서 2000 RCF로 5분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 세포를 물에 재현탁한 뒤 다시 원심분리하여 세척합니다. 두 번째 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고 세포를 적정량의 플레이팅 용액(plating solution)으로 재현탁합니다. 용액 내의 효소(zy)가 세포벽을 분해하여, 적은 양의 용해 버퍼(lysis buffer)만으로도 세포를 효율적으로 용해할 수 있게 됩니다. 30 °C에서 30분 동안 배양합니다.이번에는 남은 플라스틱 세포들을 800 RCF에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 상층액을 완전히 제거하고 각 펠릿을 100 µL의 용해 버퍼에 재현탁합니다. 그다음, 블록을 테이프로 덮고 고속으로 2분 동안 볼텍싱합니다.이렇게 하면 4,000 RCF에서 2분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 가라앉힐 수 있습니다. 상층액을 96-웰 PCR 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.일반적으로 당사 실험실에서는 한 번에 수백 개의 샘플을 분석하므로, 이를 보조하기 위해 액체 핸들링 시스템을 사용합니다. 필요한 경우, 용해물의 단백질 농도를 측정하십시오. 다음으로, 샘플에 4x 샘플 버퍼를 첨가하여 1x 샘플 버퍼가 포함된 용해물을 만든 후 실온에서 5분 동안 배양하십시오.이제 샘플을 젤에 로딩합니다. 필요한 경우, SDS page 분석을 위해 샘플의 절반을 보관하십시오. 또한, 프리스테인 마커와 닭 flector s extract와 같은 초고분자량 마커를 포함한 분자량 마커를 로딩합니다.필요한 경우, 저분자량 단백질의 확산을 방지하기 위해 젤을 차갑게 유지하는 것이 중요하므로 저온실에서 진행하는 것이 좋습니다. 젤 길이 1cm당 3V 미만의 낮은 전압으로 젤을 전기영동하십시오. 염료가 젤 끝에서 약 1cm 거리까지 도달할 때까지 수 시간 동안 전기영동을 수행하십시오.아밀로이드는 상온의 2% SDS에 의해 변성되지 않으므로, 대부분의 비아밀로이드 응집체를 포함한 다른 복합체들이 2% SDS 존재 하에 해리되는 동안 아밀로이드는 온전한 상태로 유지됩니다. 따라서 대부분의 단백질은 단량체 상태가 되어 젤을 빠르게 통과하는 반면, SDS에 내성이 있는 고분자량 아밀로이드는 더 느리게 이동하게 됩니다.이후 겔은 전이 준비가 완료됩니다. 여러 가지 전이 방법을 사용할 수 있지만, 모세관 전이(capillary transfer)를 사용할 때 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 모세관 전이는 어떤 크기의 겔도 수용할 수 있으므로, 수백 개의 샘플을 분석하는 데 실용적입니다.건조된 블로팅 페이퍼 적층체는 버퍼를 젤 사이로 끌어당겨, 페이퍼와 젤 사이에 배치된 니트로셀룰로오스 막에 단백질을 전사시키는 역할을 합니다. gel과 동일한 크기로 high bond C, extra와 같은 니트로셀룰로오스를 절단하여 준비하십시오. 또한 gel과 동일한 크기로 GBO 04 블로팅 페이퍼 20장과 GBO 02 블로팅 페이퍼 8장을 절단하여 준비하십시오.GB04는 매우 두껍고 흡수력이 좋습니다. 반면 GB02는 훨씬 더 얇고 질감이 섬세하여 멤브레인과 더 고르게 접촉할 수 있습니다. 심지로 사용할 GB04 조각을 추가로 자르되, 겔이 담긴 너비보다 약 20 cm 더 넓게 준비하십시오.플라스틱 용기에 nitrous UL WIC, GBO 02 4장, XTBS 1장을 준비하고, 다음과 같이 거름종이 층을 쌓습니다. 먼저 건조된 GBO 04 20장을 쌓습니다. 그다음 건조된 GBO 02 4장을 쌓습니다. 마지막으로 미리 적신 GBO 02 1장을 쌓습니다.이 적층물 위에 니트로셀룰로오스를 올립니다. 캐스팅 트레이 위의 겔을 물로 짧게 헹궈 과잉의 러닝 버퍼를 제거합니다. 그런 다음, 필요에 따라 TBS를 뿌려 멤브레인을 적시면서, 겔을 트레이에서 적층물 위로 조심스럽게 밀어 옮기기 시작합니다.추가 버퍼는 기포가 겔 내부에 갇히는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 겔을 스택으로 완전히 옮긴 후에는 전이 피펫을 사용하면 이 작업에 효과적입니다. 기포가 있는지 철저히 확인하십시오.겔의 가장자리를 들어 올리고 기포가 제거될 때까지 버퍼를 다시 도포합니다. 미리 적신 나머지 3개의 GBO oh two 조각을 겔 위에 올립니다. 스택의 상단을 피펫으로 단단히 밀어 굴려 모든 층이 완전히 밀착되도록 합니다.TBS가 담긴 두 개의 높은 트레이로 전사 스택의 양옆을 받치고, 심지(wick)의 양 끝이 트레이에 잠기도록 미리 적신 심지를 스택 위에 걸쳐 놓습니다. TBS 내에서 조립된 전사 스택 위를 500 mL 생수병과 같이 무게감이 있는 추가 플라스틱 트레이로 덮어줍니다. 심지가 트레이에서 완충액을 끌어오면, 건조한 블로팅 페이퍼가 몇 시간에 걸쳐 겔을 통해 완충액을 끌어당기게 됩니다.이렇게 하면 단백질이 막에 침전되며, 전이 과정이 최소 3시간 또는 밤새 진행되도록 합니다. 모세관 전이가 완료되면, 막을 표준 웨스턴 블로팅법으로 처리할 수 있습니다. 여기 보시는 것은 특정 단백질이 아밀로이드를 형성하도록 유도하는 효모 균주에서 과발현된 단백질의 전형적인 블롯 결과입니다.여기 그리고 여기에 표시된 것과 같이, 일부 후보 물질들은 아밀로이드 또는 고분자량의 SDS 내성 종을 매우 잘 형성하는 것을 명확히 확인할 수 있습니다. 반면, 이들과 이들처럼 응집체를 형성하지 않고 완전히 단량체 상태로 존재하는 것들도 있습니다. 또한, 이 두 레인에서 볼 수 있듯이 단백질에 따라 아밀로이드 중합체의 크기가 서로 다르다는 것을 알 수 있습니다.지금까지 후보 프리온의 아밀로이드와 같이 고분자량의 불용성 응집체를 분석하는 간단한 방법을 보여드렸습니다. 저희의 발표가 유익하셨기를 바라며, 이 기술이 아밀로이드 면역원성 단백질 연구에 도움이 되기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 연구에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 명확히 인간 대뇌 피질 homogenates, SDS - PAGE로 단백질 분리, 항원 검색 및 Aβ 펩타이드에 대한 항체와 immunoblotting의 준비를위한 기술을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리 현상과 인간의 대뇌 피질 조직에서 monomeric 및 multimeric Aβ를 감지합니다.

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

이 비디오는 단백질에 대한 변성 폴리아크릴아미드 기반 분리 기술을 보여줍니다. 이 기술은 분자량에 따라 단백질을 예비 식별하는 데 도움이 됩니다.

단백질 분석을 위한 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel 전기영동: 분자량에 따라 단백질을 분리하고 시각화하는 기술

이 비디오는 아밀로이드 섬유의 2차원 반변성 세제 아가로스 젤 전기영동 기반 분리를 보여줍니다. 이 기술은 이질적인 크기에 따라 다형성 아밀로이드 응집체를 분리합니다.

2차원 반변성 아가로스 겔 전기영동: 크기 이질성에 따라 다형성 아밀로이드 섬유를 분리하는 기술

단백질은 네이티브 구조를 채택하거나 불용성 아밀로이드로 잘못 접힐 수 있습니다. 잘못 접히는 경로를 선호하는 조건은 다양한 유형의 아밀로이드 섬유의 형성으로 이어집니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 in vitro에서 네이티브 단백질을 아밀로이드로 빠르게 전환할 수 있습니다.

천연 단백질에서 아밀로이드의 빠른 생성<em&gt; 체외</em

간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

여기 우리를 사용 하 여 2 차원 반 변성 agarose 젤 전기 이동 법 다른 유형의 크기의 아 밀 로이드 같은 섬유의 존재를 확인 하 고 크기가 젤 동안 녹말 체 섬유의 분리로 인해 가능성을 제외 실행 중인 프로세스입니다.

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

이 보고서는 생물학적 샘플에서 황지방 글리코아미노글리칸(GAGs)을 분리하고 정화하는 기술과 크기를 대략적으로 분류하기 위한 폴리아크릴아미드 젤 전기포아제 접근법을 설명합니다. GAGs는 조직 구조에 기여하고 단백질과의 정전기 상호 작용을 통해 신호 공정에 영향을 미칩니다. GAG 폴리머 길이는 코그네이트 리간드에 대한 결합 친화성에 기여합니다.

폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출

이 프로토콜은 프로테오독성 항균제로 치료 한 후 대장균에서 집계 및 수용성 단백질의 추출 및 시각화를 설명합니다. 이 절차에 따라 다른 세균성 균주 및 /또는 치료 사이에 생체 내에서 단백질 골집 형성의 질적 비교를 할 수 있습니다.

프로테오독성 스트레스로 대장균 치료 후 단백질 골재의 추출 및 시각화

여기에서는 인간 γ-세크레타아제를 재구성하는 효모 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템을 통해 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 식별 및 연구하고 γ-secretase 억제제(GSI)를 스크리닝할 수 있습니다. 가족성 알츠하이머병 돌연변이의 기능 상실 특성을 활용하여 γ-secretase 조절제(GSM)를 스크리닝할 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae γ-Secretase에 의한 아밀로이드 베타 생산에 영향을 미치는 유전자, 돌연변이 및 화학 물질을 스크리닝하는 알츠하이머병 모델

본 연구는 GFAP와 그 병을 유발하는 돌연변이를 생화학적으로 특성화하기 위한 실험적 방법을 개략적으로 제시하며, 필라멘트 조립, 응집, 번역 후 변형에 중점을 둡니다. 고순도 GFAP 단백질을 분석하여 알렉산더병 기전에 대한 통찰을 밝혀내어 잠재적 치료 표적 연구와 GFAP 돌연변이 및 관련 질환 이해에 대한 틀을 제공하였습니다.

교세포섬유산성 단백질 및 그 질병 관련 변이체의 생화학적 분석에 대한 실험적 접근법

배우세요 세미 변성 세제 아가로오스 겔 전기영동(SDD-AGE)을 사용하여 아밀로이드 유사 중합체를 검출하고 특성화하는 방법을. 이 기술은 프리온 및 기타 집합체 형성 단백질을 선별하는 데 활용됩니다.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

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