세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

안녕하세요, 저는 MIT 생물학과의 수잔 라이너스 연구소(Susan Linus Laboratory)의 대학원생인 랜달 호프만(Randall Hoffman)입니다. 오늘은 반변성 세제 아그로 로즈, 겔 전기영동 또는 SDD 시대에 대해 소개하려고 합니다. 우리 실험실에서는 이 기술을 사용하여 프리온 및 기타 알로겐 단백질을 스크리닝합니다.

당사의 SDD 연대 버전은 간단하고 신뢰할 수 있으며 여러 샘플을 수용할 수 있도록 확장할 수 있습니다. 아밀로이드는 SDS에 의한 변성에 매우 강하여 SDDH를 사용하여 다른 단백질과 분리할 수 있습니다. 그러나 SDDH의 데이터만으로는 무언가가 아밀로이드인지 확인하는 데 사용할 수 없습니다.

그렇게 하려면 다른 기술을 사용해야 합니다. 그 점을 염두에 두고 보여드리겠습니다. S-D-D-H-S-D-D-H는 수평 DNA 전기영동을 위한 표준 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다.

먼저 젤 캐스팅 트레이를 조립해야 합니다. 장치의 크기는 얼마나 많은 샘플이 있는지에 따라 다릅니다. 많은 수의 샘플의 경우 20 x 24cm 슬래브와 최대 4개의 50 웰 콤을 사용합니다.

겔을 준비하려면 중간 또는 높은 겔 강도 낮음, EEO 아그로스, XTAE 완충액 1개, SDS의 10% 스톡 용액이 필요하며 1.5% AROS 용액과 XTAE 1개가 필요합니다. 가장 많은 샘플을 로드하고 검출을 최대화할 수 있도록 젤을 가능한 한 두껍게 만드는 것이 좋습니다. 아로스가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 전자레인지에 가열합니다.

100 XSDS 스톡을 0.1 %에 빠르게 추가하고 소용돌이 치십시오. 이 단계에서 일부 농어가 굳으면 빨간색으로 핫 플레이트에 용해시킵니다. 끓지 않도록 주의하세요.

용액으로 SDS를 첨가한 후 용액이 쉽게 거품이 일기 때문에 이 용액이 뜨거울 때 주조 트레이에 붓습니다. 그런 다음 빗을 사용하여 나중에 젤 전달 중에 방해가 될 수 있는 거품을 제거합니다. 젤이 완전히 냉각되고 응고된 후 빗을 조심스럽게 제거하고 젤을 탱크에 넣습니다.

0.1% SDS로 하나의 XTAE에 젤을 완전히 담그십시오. 이제 샘플을 로드할 준비가 되었습니다. SDDH에 사용되는 단백질 샘플은 두 가지 중요한 예외를 제외하고는 SDS 페이지와 동일하게 준비됩니다.

먼저, 응집체를 단백질 단량체로 변성시킬 수 있는 시료를 가열하지 않아야 합니다. 둘째, 단백질 분해를 피하도록 주의하십시오. 여기에 사용된 변성 조건은 모든 프로테아제를 비활성화하기에 충분하지 않기 때문에 완전 프로테아제 억제제 칵테일의 권장 농도의 최소 2배를 사용하는 것이 좋습니다.

이 시연에서는 관심 있는 특정 단백질을 과도하게 발현하는 효모 세포의 용해물을 사용합니다. 우리는 일반적으로 하룻밤 사이에 2mil을 사용합니다. 96에서 성장한 배양액은 VWR에서 사용할 수 있는 웰 블록이지만 저농도 단백질을 분석할 때는 더 많은 배양 부피를 사용해야 합니다.

원심분리 후 배양액을 2000 RCF에서 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 수확하고, 상층액을 제거하고 Resus를 물에 현탁시켜 2차 스핀 후 다시 원심분리하여 세포를 세척한 후 상등액을 제거하고 여분의 도금액으로 세포를 수지화합니다. 용액의 zy는 세포벽을 소화하여 세포를 효율적으로 분해하고 소량의 용해 완충액을 얻을 수 있습니다. 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다.

여분의 플라스틱 셀을 펠릿으로 만들고 이번에는 800 RCF에서 5분 동안 사용합니다. sate를 완전히 제거하고 각 펠릿과 100마이크로리터의 용해 완충액을 재현탁합니다. 다음으로, 테이프로 블록을 덮고 2분 동안 고속으로 와류를 탑니다.

이것은 모든 구체 플라스틱이 4, 000 RCF에서 세포 파편을 PLY 밖으로 내보내는 데 도움이 됩니다. 2분 동안. S natin을 96웰 PCR 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.

일반적으로 우리는 실험실에서 한 번에 수백 개의 샘플을 분석하므로 이를 돕기 위해 액체 처리 시스템이 있습니다. 원하는 경우 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. 다음으로, 4개의 x 샘플 버퍼를 샘플에 추가하여 실온에서 5분 동안 1개의 x 샘플 버퍼 배양을 포함하는 용해물을 생성합니다.

이제 샘플을 젤에 넣습니다. 원하는 경우 SDS 페이지 분석을 위해 샘플의 절반을 저장합니다. 또한 미리 염색된 마커와 닭 플렉터 추출물과 같은 매우 높은 분자량 마커를 포함한 분자량 마커를 로드합니다.

원하는 경우 저분자량 단백질의 확산을 방지하기 위해 젤을 시원하게 유지하는 것이 중요하므로 차가운 방에서 실행하는 것이 좋습니다. 젤 길이의 센티미터당 3볼트 미만의 낮은 전압에서 젤을 실행합니다. 디아레가 젤 끝에서 약 1cm에 도달할 때까지 몇 시간 동안 젤을 실행합니다.

아밀로이드는 실온에서 2%SDS에 의해 변성되지 않기 때문에 대부분의 비 아밀로이드 응집체를 포함한 다른 복합체가 2%SDS가 존재할 때 해리되는 동안 그대로 유지됩니다. 그러므로, 대부분의 단백질은 단량체이고 겔을 통해 빠르게 실행됩니다. SDS 저항성이 높은 분자량 아밀로이드는 더 천천히 이동합니다.

그 후, 젤은 전사 할 준비가됩니다. 여러 전달 방법을 사용할 수 있지만 모세관 전달을 사용하여 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 모세관 이식은 모든 크기의 겔을 수용할 수 있기 때문에 모세관 이식에서 수백 개의 시료를 분석하는 것이 실용적입니다.

건조 블로팅 페이퍼 스택은 겔을 통해 완충액을 끌어당겨 종이와 젤 사이에 위치한 니트로셀룰로오스 멤브레인에 단백질을 증착시키는 역할을 합니다. 하이 본드 C와 같은 니트로셀룰로오스 조각을 젤과 동일한 치수로 추가로 절단해야 합니다. 또한 GBO 오 포 20장과 GBO 오 투 블로팅 페이퍼 8개를 젤과 같은 크기로 잘라야 합니다.

GB 오 포는 매우 두껍고 흡수력이 있습니다. GBO oh two는 훨씬 더 얇고 질감이 더 미세하여 멤브레인과 더 균일한 접촉을 보장합니다. 심지로 사용할 GBO 오 4 조각을 추가로 자르고 담근 젤보다 약 20cm 넓게 만듭니다.

플라스틱 용기에 담긴 아질산 UL WIC와 GBO 오 2개 및 1개의 XTBS 4개는 다음과 같이 종이 더미를 조립하고 건조 GBO 오 4개 20개를 조립합니다. 그런 다음 드라이 GBO 4 개 오 둘. 그런 다음 미리 젖은 GBO 한 조각, 오 둘.

이 스택 위에 니트로셀룰로오스를 놓습니다. 주조 트레이의 젤을 물에 잠시 헹구어 과도한 흐르는 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 트레이에서 젤을 스택으로 조심스럽게 밀어 넣기 시작하고 트레이에서 젤을 밀어 필요에 따라 멤브레인에 TBS를 묻힙니다.

추가 버퍼는 거품이 젤에 갇히는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 전사 피펫은 겔이 스택으로 완전히 이동된 후 이러한 목적으로 잘 작동합니다. 기포가 있는 경우 철저히 확인하십시오.

젤의 가장자리를 들어 올리고 거품이 해결될 때까지 버퍼를 다시 바르십시오. 젤 위에 나머지 3개의 미리 젖은 GBO 오 두 조각을 놓습니다. 스택 상단을 가로질러 피펫을 단단히 굴려 모든 층 사이의 완전한 접촉을 보장합니다.

TBS가 들어 있는 두 개의 높은 트레이가 있는 전사 스택 측면의 측면에 심지의 한쪽 끝이 잠기도록 스택을 가로질러 미리 젖은 심지를 드레이프합니다. TBS에서는 조립된 전사 스택을 500mil 물병과 같은 추가 무게를 지닌 추가 플라스틱 트레이로 덮습니다. 심지는 트레이에서 완충액을 끌어내고 마른 압지는 몇 시간에 걸쳐 젤을 통해 완충액을 끌어당깁니다.

이렇게 하면 단백질이 멤브레인에 침전되어 전달이 최소 3시간 또는 하룻밤 동안 진행될 수 있습니다. 모세관 이동이 완료된 후 멤브레인은 표준 웨스턴 블로팅으로 처리할 수 있습니다. 여기에서 효모 균주에서 과도하게 발현된 단백질의 전형적인 블롯을 볼 수 있으며, 이는 특정 단백질이 아밀로이드를 형성하기 쉽

우리의 후보 중 일부는 여기와 여기에 표시된 것과 같이 아밀로이드 또는 고분자량 SDS 내성 종을 매우 잘 형성한다는 것을 분명히 볼 수 있습니다. 그러나 다른 것들은 응집체를 형성하지 않으며 이러한 응집체와 같이 완전히 단량체입니다. 또한 단백질에 따라 아밀로이드 중합체의 크기가 다르다는 것을 알 수 있으며, 이는 이 두 레인에서 볼 수 있습니다.

방금 후보 프리온의 아밀로이드와 같은 고분자량의 불용성 응집체를 분석하는 간단한 방법을 보여드렸습니다. 저희 프레젠테이션을 즐겁게 시청하셨기를 바라며, 이 기술이 유용하고 Amy 면역원성 단백질에 대한 연구가 도움이 되었기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사드리며 연구에 행운을 빕니다.