설치류에 살아서 Stereotaxic 외과

안녕하세요, 저는 Tufts University School of Medicine 약리학 및 실험 치료학과의 Emmanuel POTOs 연구실 소속 Brenda Geiger입니다. 그리고 저 또한 해당 연구실 소속인 Lauren Frank입니다. 오늘은 설치류를 대상으로 한 생존 가능한 정위 수술 방법을 시연하겠습니다.

이 절차는 기기를 설정하고 수술을 위해 동물을 준비한 후, 정위 수술을 수행하는 과정으로 구성됩니다. 그럼 시작하겠습니다. 절차를 시작하기 전, 정위 수술 기기와 필요한 모든 재료를 준비하십시오.

작업 구역과 기구들이 세척 및 멸균되었는지 확인하십시오. 다음으로, 수술을 위해 동물을 준비합니다. 오늘은 10주령의 Sprague Dawley 랫트를 사용하여 수술 과정을 시연하겠습니다.

또한 3개월 된 Sprague Dawley 랫드와 전용 플랫폼 어댑터가 필요한 2개월 된 C57BL/6J 마우스를 사용합니다. 60 mg/kg의 ketamine과 10 mg/kg의 xylazine이 포함된 칵테일을 IP 주사하여 랫드를 마취합니다. 서모스탯으로 조절되는 가열 패드를 사용하여 동물을 따뜻하게 유지하십시오.

동물이 진정되었으며 적절한 체온이 유지되어 안정된 것을 확인한 후 수술을 진행합니다. 수술을 시작하려면 전기 면도기를 사용하여 귀부터 양눈 사이까지 동물의 털을 깎습니다. 면도한 부위에 요오드를 도포하되, 눈에 들어가지 않도록 주의하십시오.

이제 동물을 정위 고정 장치(stereotaxic apparatus)에 고정합니다. 이를 위해 먼저 한쪽 귀 바(ear bar)를 외이도에 장착한 다음, 고정 상태를 유지하면서 다른 쪽 귀 바를 밀어 넣어 머리가 좌우로 움직이지 않게 하되, 코끝(snout)은 위아래로 움직일 수 있도록 합니다. 정위 고정 기구 사용자 자의 전방 마운트로 입 부분을 고정하여 머리가 수평이 되었는지 확인하십시오.

자(ruler)와 동물의 두피 중앙은 90도 각도를 이루어야 합니다. 동물의 위치가 고정되면, 멸균된 메스로 두피에 전후 절개를 실시합니다. 절개 부위를 람다(lambda)부터 동물의 양 눈 사이까지 확장합니다.

지혈 겸자를 사용하여 피부를 집어 고정하고 절개 부위를 개방된 상태로 유지합니다. 노출된 두개골 표면을 여러 개의 면봉으로 닦아 건조합니다. 다음으로, 가이드 캐뉼라를 마운트에 장착합니다.

그런 다음 두개골에서 bgma를 찾아 가이드 캐뉼라를 이 위치 바로 위에 배치합니다. bgma로부터의 전방, 후방 및 측방 좌표를 기록하십시오. 프로브 삽입에 필요한 정확한 좌표를 찾으십시오.

정위 뇌지도(stereotactic atlas)를 이용하여 bgma로부터 값을 더하거나 빼서 가이드 캐뉼라를 정확한 좌표에 위치시킵니다. 가이드 캐뉼라가 두개골에 닿을 때까지 내린 후, 이 복측(ventral) 좌표를 기록합니다. 두개골의 이 위치에 연필로 표시를 합니다.

이곳이 드릴링할 위치입니다. 드릴링을 시작하려면 가이드 캐뉼라를 제거하고 드릴 비트를 멸균하십시오.

그런 다음 두개골의 두께를 완전히 관통할 때까지 연필로 표시한 지점에 0.5 millimeter 구멍을 뚫습니다. 가이드 캐뉼라를 사용하여 측면에 닿지 않고 구멍을 통과하는지 확인합니다. 캐뉼라가 직선 경로로 구멍을 통과할 수 있을 때까지 드릴링과 확인 과정을 반복합니다.

수막이나 혈관을 관통하지 않도록 주의하십시오. 구멍을 낸 후에는 멸균 바늘을 사용하여 수막을 부드럽게 뚫어 가이드 캐뉼라가 방해 없이 삽입될 수 있도록 합니다. 다음으로, 핸드 드릴을 사용하여 두개골 나사용 구멍 6개를 만듭니다.

캐뉼라 구멍을 기준으로 전방에 두 개, 측면에 두 개, 후방에 두 개를 배치합니다. 6개의 스테인리스강 골 고정 나사를 멸균한 후, 두개골에 단단히 고정될 때까지 나사를 박습니다. 나사를 삽입한 후, 가이드 캐뉼라를 에탄올로 세척하고 건조시킨 다음, 가이드를 장착하여 적절한 복측 좌표까지 천천히 내립니다.

뇌 손상을 방지하기 위해 캐뉼라를 위아래로 천천히 내립니다. 측면이 닿지 않고 완전히 수직으로 삽입되고 있는지 확인하십시오. 그 후 지혈鉗(hemostats)을 제거합니다.

액상 치과용 시멘트를 얇게 혼합한 후, 스패튤라를 사용하여 가이드 캐뉼라, 나사 및 두개골의 나머지 부분을 얇은 층으로 덮습니다. 다음으로, 앵커 나사를 후방 두개골 나사의 내측 및 후방에 배치하고 핀셋으로 고정합니다. 이번에는 시멘트를 더 두껍게 다시 혼합하여 캐뉼라와 앵커 나사를 완전히 덮어, 시멘트가 굳었을 때 이들이 확실히 고정될 수 있도록 충분한 양의 시멘트를 도포합니다.

하지만 시멘트가 굳기 전에 피부와 시멘트 캡을 분리하고, 스패출러로 시멘트 캡을 성형하여 전체적으로 매끄럽게 만들어 피부에 자극을 주지 않도록 합니다. 이후, 가이드 캐뉼라를 보강하고 헤드 마운트의 나머지 부분과 연결하기 위해 시멘트를 더 추가합니다. 치과용 시멘트가 완전히 마른 후, 장치에서 동물을 제거합니다.

그런 다음 시멘트 캡 주변 전체에 국소 항생제인 바시트라신(bacitracin)을 도포합니다. 다음으로 페니실린을 근육 주사하고, 이어서 식염수를 피하 주사합니다. 동물을 케이지에 넣고 의식을 회복할 때까지 관찰합니다.

그 후 동물을 케이지로 옮겨 회복시킵니다. 회복 후에는 실험 종료 시까지 매일 동물을 관찰하여 감염 징후를 확인하고 통증 및 고통 정도를 평가합니다.

동물이 통증을 느끼는 것으로 보일 경우, 필요에 따라 0.1~0.5 mg/kg의 buprenorphine을 1일 2회 피하 투여합니다. 또한, 국소적으로 bacitracin 처치를 시행하고 전신적으로 penicillin 투여를 실시합니다. 수술 후 감염이 발생하거나 수술 후 12시간 이상 증상이 지속되는 경우, 해당 동물은 안락사시킵니다.

지금까지 설치류에서 생존 가능한 정위 수술을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 감염을 방지하기 위해 수술 중 무균 환경을 유지하고 수술 후 동물을 면밀히 관찰하는 것이 중요하며, 가이드 캐뉼라의 위치가 정확하도록 동물을 에어바(air bars) 위에 올바르게 배치해야 한다는 점을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.