조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

이 절차는 배아의 고정, 메탄올 및 단백질 분해 효소 K 처리로 시작하여 프로브 1 diggen in 또는 dig and probe를 사용하여 하룻밤 배양합니다. 두 개의 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 ZI 배아를 dig 알칼리 인산가수분해효소와 색 반응 후 dig 항체와 함께 배양합니다. 활성이 비활성화되고 배아가 배양됩니다.

FSE를 사용하면 Zi와 함께 항체 색 반응이 수행되고 배아가 고정됩니다. 안녕하세요, 저는 휴스턴에 있는 텍사스 a 및 m 대학의 환경 및 게놈 의학 센터의 Rick Finnel 연구실에서 근무하는 Delphine입니다. 오늘 우리는 병아리 배아에서 두 개의 착색제 제자리 교잡을 수행하는 절차를 보여 드리겠습니다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 항간질제가 위와 신경 유전자에 미치는 영향을 분석합니다. 자, 이제 시작하겠습니다: 병아리 배아에 대한 현장 교배를 수행하려면 먼저 집게로 껍질을 두드리고 껍질 조각을 제거하여 난자를 엽니다. 집게로 두꺼운 알부민을 제거하고 거친 집게로 노른자 자루를 기울여 배아가 위를 향하도록 가늘게 가위를 사용합니다.

배아 주위를 사각형의 노른자 자루로 자릅니다. 숟가락으로 노른자에서 배아를 제거하고 얼음이 담긴 접시에 담습니다. 해부 현미경으로 PBS를 차갑게 합니다: 멤브레인과 ylk를 조심스럽게 제거하고 배아를 얼음이 담긴 신선한 접시에 옮깁니다.

Cold dey PBS는 집게로 배아를 누르고 흄 후드에서 dey PBS를 흡인합니다. 이것을 데이 PBS의 4% 파라폼 알데히드로 대체하고 배아가 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 고정되도록 합니다. 배아가 고정된 후 고정액을 흡인하고 화학 폐기물로 적절하게 처리합니다.

뭉툭한 끝의 마이크로 모세관 바늘 또는 현미 해부 칼을 사용하여 접시에 얼음처럼 차가운 데이 PBS를 채우고 머리와 심장 구멍을 뚫습니다. 프로브가 끼는 것을 방지합니다. 배아를 0.1%tween 20을 포함하는 DEP CPBS에 넣은 다음 PBT에서 25%50%75% 및 100%메탄올로 각각 10분 동안 메탄올 시리즈 세척으로 배아를 탈수합니다.

100% 메탄올 세척을 반복합니다. 배아는 이제 영하 20도의 메탄올에 저장될 수 있습니다. 20 밀리리터 유리 섬광 바이알에 들어 있습니다.

인사이튜 교잡을 수행하려면 먼저 배아를 재수화해야 합니다. 이렇게하려면 PBT에서 75 % 50 % 및 25 % 메탄올로 배아를 각각 10 분 동안 세척합니다. 마지막으로 각각 10분씩 두 번 씻습니다.

PBT에서 바이알에서 PBT 용액을 제거하고 밀리리터당 5마이크로그램의 proteinase K 용액으로 교체합니다. 바이알당 3밀리리터. 바이알을 부드럽게 굴려 전체 내용물이 proteinase K 용액에 노출되도록 했습니다.

배아 단계에 따라 proteinase K 용액에 1-5분 동안 그대로 둡니다. 한편, RNA free past 피펫을 사용하여 얼음 저온 고액을 준비하고, proteinase K 용액을 제거하고, 고정액 2ml를 첨가합니다. 즉시 바이알을 얼음 위에 정확히 20분 동안 놓습니다.

다음으로, 돌연변이원(mutator)에서 실온에서 배아를 세척합니다. PBT에서 10분 세척 2회 후 PBT의 50% 혼성화 버퍼에서 10분 세척 1회를 수행합니다. 그런 다음 100% 교잡 완충액에서 한 번 세척하고 4-5시간 동안 2ml의 교잡 완충액에서 배아를 배양합니다.

섭씨 65도에서. 배아는 이제 probes dig 및 fitzy coupled probe synthesis와 혼성화될 준비가 되었습니다. 강한 신호를 줄 것으로 예상되는 probe는 nucleotides를 함유한 FSE로 합성해야 하고, 약한 probe는 nucleotides를 함유한 dig로 합성해야 합니다.

2밀리리터 바이알을 사용하여 혼성화 버퍼의 프로브를 사전 경고합니다. 배아에서 혼성화 완충액을 제거하고 혼성화 완충액을 프로브 용액으로 즉시 교체하십시오. 건조된 배아가 섭씨 65도에서 16시간 동안 배아를 배양하지 않도록 하는 것이 중요합니다.

프로브 혼성화 단계 후 프로브 용액을 혼성화 버퍼로 교체합니다. 섭씨 65도에서 30분 동안 두 번 세척한 다음 섭씨 65도에서 다시 혼성화, 완충액 및 말레산 완충액의 일대일 혼합물로 15분 동안 세척합니다. 이 단계가 끝나면 더 이상 RNA가 없는 조건을 사용할 필요가 없습니다.

이제 dig 색상 반응을 수행한 다음 Fitz 색상 반응을 수행할 준비가 되었습니다. 항체 혼성화와 색 반응을 먼저 수행하기 위해 말레산 완충액에서 배아를 각각 20분씩 두 번 세척합니다. 그런 다음 말레산 완충액에서 2% VBR로 1시간 동안 세척합니다.

마지막으로, 차단 완충액에서 5시간 동안 관찰하고, 차단 완충액에서 항체를 1에서 2000까지 묽게 파고, 이 용액의 배아를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 돌연변이체에서 배양합니다. 다음날에는 말레산 완충액에서 10분 세척을 10분 동안 3회 세척한 후 말레산 완충액을 1시간 동안 3회 세척합니다. 각각 20분씩 두 번 씻으십시오.

NTMT에서 200 밀리리터에 200 마이크로 리터 N-B-T-B-C-I-P 기판을 추가합니다. NTMT는 즉시 배아가 있는 바이알에서 NTMT를 제거하고 1-2밀리리터로 교체합니다. N-B-T-B-C-I-P 버퍼는 어두운 곳에 둡니다.

20분 후와 그 후 20분 간격으로 색상 반응을 모니터링합니다. 파란색이 적절하게 발달하면 PBS에서 배아를 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 PBS에서 PBS를 4% 파라폼 알데히드로 교체합니다.

밤새 섭씨 4도에서 고정하십시오. 배아를 PBT에서 10분씩 두 번 세척한 다음 말레산 완충액에서 10분 동안 두 번 세척하는 새로운 syn 설치 바이알로 옮깁니다. 말레산 완충액에 배아를 섭씨 65도에서 30분 동안 배양합니다.

이제 두 번째 항체 배양 및 색상 반응을 수행할 차례입니다. 두 번째 적합 e 표지 프로브를 검출하려면 말레산 완충액에서 배아를 각각 10분 동안 두 번 세척합니다. maleic 산 완충액에 있는 2%BBR에서 1 시간.

그런 다음 5시간 동안 차단 완충액에서 알칼리성 인산가수분해효소 결합 항 FTSE 항체를 차단 완충액에서 1에서 500까지 희석하고 이 용액의 배아를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날 아침에는 말레산 완충액을 10분간 3회 세척한 후 말레산 완충액을 1시간 동안 3회 세척했습니다. 그런 다음 각각 20분씩 두 번 씻습니다.

Tris HCL에서 제조업체의 프로토콜에 따라 tris HCL에서 5ml의 벡터 레드 작업 용액을 준비합니다. 즉시 바이알에서 트리스 HCL을 제거하고 vector red buffer로 교체합니다. 바이알을 어두운 곳에 두십시오.

30분 후와 30분 간격으로 붉은색이 발달한 후 배아를 PBS로 이식합니다. 드디어 배아를 고정하고 처리할 준비가 되었습니다. 4%의 파라폼, 알데히드가 함유된 고정 접시에 옮기고 실온에서 20분 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 고정합니다.

PBS에서 두 번 세탁, 사진 촬영을 위해 세탁 당 10 분. PBS에서 배아를 20% 글리세롤로 옮깁니다. 이것은 배아를 왁스 절편을 위해 처리하기 위해 반투명하게 만듭니다.

배아를 PBS로 다시 옮기고, 10분씩 두 번씩 세척하고, 메탄올 시리즈에서 각각 10분씩 탈수하고, 메탄올을 프로판올로 교체하고 3분 동안 배양합니다. 프로판올을 제거하고 1 2 3 4 테트라 하이드로 냅 필린으로 20분 동안 교체한 다음 히스토 클리어로 각각 1시간씩 두 번 세척합니다. 히스토 클리어와 왁스를 일대일 혼합물로 교체하고 섭씨 60도에서 1시간 동안 배양합니다.

이 용액을 왁스로 교체하고 조직학을 위해 처리하십시오. 이 배아는 양말에 digo 산소, 파란색으로 표시된 두 개의 프로브, 빨간색으로 표시되는 fitzy delta 프로브 1개로 표시되어 있습니다. 첫 번째 색상 반응은 양말의 표현 패턴을 나타냅니다. 2.

Dr.Robin level badge sox의 실험실에서 개발 된 신경 플레이트의 마커는 N-B-T-B-C-I-P와 반응 한 후 두 개의 양성 세포가 파란색으로 나타납니다. 그런 다음 동일한 배아가 두 번째 색 반응을 위해 처리되어 델타 원의 발현 패턴을 나타냅니다. Domingo Enrique Delta 박사의 실험실에서 개발된 분절 플레이트에 대한 마커는 벡터 빨간색과 반응한 후 양성 세포가 빨간색으로 나타납니다.

이 배아는 파란색의 PAC six 프로브의 digo와 빨간색의 fitzy SHH 프로브로 표시되어 있습니다. 첫 번째 색상 반응은 PAC 6의 발현 패턴을 보여주며, Martin Goulding Pac 박사의 실험실에서 개발 된 신경 주름 및 개발 솜 세포에 대한 마커입니다. 6 개의 양성 세포는 N-B-T-B-C-I-P와 반응 한 후 파란색으로 나타납니다.

두 번째 색 반응은 Dr.Cliff Tabban의 실험실에서 개발된 신경관의 Noor와 복부 정중선에 대한 SHHA 마커의 발현 패턴을 보여줍니다. SHH 양성 세포는 벡터 빨간색과 반응한 후 빨간색으로 나타납니다. 우리는 방금 치킨 리에서 색칠 및 c 하이브리드화를 수행하는 방법을 보여주었습니다.

이 절차를 수행할 때 뎁스 C 처리 용액과 오토클레이브, pfas 및 멸균 vi를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. RNAs와의 접촉을 극소화하는 것은 단계 3에서 5에 있다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.