Name: Thymus 문화 Reaggregate (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 학습하세요 2-dGuo 처리된 재응집 흉선 배양법으로 T세포 분화와 세포 간 상호작용을 연구하는 방법을. CD4 및 CD8 양성 T세포 하위집합 생성과 양성 및 음성 선택 연구에 활용할 수 있습니다.

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thymus 문화를 reggregate 준비에 대한 자세한 내용은 방문하시기 바랍니다 <a href="http://www.springerprotocols.com/">스프링거 프로토콜을</a> .

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

thymus 문화 reaggregate

Reaggregate Thymus Cultures

thymus, 미숙 CD4 8 + 무작위로 재배열 T - 세포 수용체를 표현 thymocytes에서 α - 및 B - 체인 유전자 self-peptide/major의 histocompatibility 복합 (MHC) thymic로 표현 분자를 인식하는 능력에 따라 긍정적이고 부정적인 선택 이벤트를 받다 stromal 세포. intrathymic 선택하는 동안 thymic stromal 세포의 역할의 생체내 분석에 정상 상태 성인 thymus에서 thymic microenvironment의 세포 복잡하여 어렵게 만든, 적절한 타겟팅 전략의 부족에 의해 특정 thymic stromal 구획의 유전자 발현을 조작할 수 있습니다. 우리는 thymic microenvironment가 쉽게 정의 stromal과 림프 세포의 입체 thymus 엽 (叶)의 준비를 허용 thymus 장기 문화를 reaggregate의 사용을 통해 체외로 조작할 수있는 것으로 나타났습니다. 체외 시스템의 다른 T 세포 개발의 일부 측면을 지원하지만, thymus 장기 문화 I 및 II - 중재 thymocyte 선택 이벤트, 그래서이 연구는 효과적인 도구로 사용할 수있는 유일한 체외 시스템의 효율적인 MHC 클래스를 지원할 수 남아 reaggregate thymus에서 긍정적이고 부정적인 선택의 세포 및 분자 규제.

이 비디오에의 준비 2 dGuo - 처리 증명 thymus 문화를 reaggregate.

Thymus 문화 Reaggregate

림프 조직 내의 기질 세포는 3차원 구조로 조직되어 있으며, 이는 세포의 이동과 ...을 조절하는 것으로 생각되는 지지체를 제공합니다.

안녕하세요, 저는 버밍엄 대학교 MRC 면역 조절 센터의 Graham Anderson 및 Eric Jenkinson 교수님 연구실 소속 Andrea White입니다. 오늘은 T 세포 분화 과정 중에 발생하는 복잡한 세포 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 재응집 흉선 기관 배양법을 소개하겠습니다. 본 절차를 시작하기 전에, 배아 흉선 엽을 분리하고 모든 림프구를 제거하는 처리를 거쳤습니다.이는 별도의 영상에서 확인하실 수 있습니다. 그 후, 외계양 엽(alienoid lobes)을 분산시켜 기질 세포 준비물을 제조합니다. 마지막으로, 세포들을 다시 응집시켜 재응집 fmic 장기 배양물을 형성합니다.시작하겠습니다. 5~7일간 배양한 후, LO를 분리하여 shoal cell을 준비할 준비가 되면 0.8 µm 필터를 10% FCS가 첨가된 RPMI 1640이 담긴 페트리 접시에 담그십시오. 핀셋을 사용하여 떠오르지 않는 섬유 덩어리를 조심스럽게 밀어내십시오. 1 mL 피펫을 사용하여 로브를 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮기십시오.각 원심 분리관(centrifuge tube)당 50개 이하의 엽(lobe)을 넣는 것을 권장합니다. 중력 상태에서 엽이 튜브 바닥으로 가라앉도록 둔 다음 배지를 제거하십시오. 1 mL의 PBS로 엽을 세척한 후, 다시 바닥으로 가라앉을 때까지 기다리십시오.이 과정을 총 3회의 PBS 세척으로 반복하고, 마지막 PBS 세척액을 제거한 후 0.25% trypsin 용액 600 µL를 첨가합니다. 마이크로 튜브를 37 °C 인큐베이터에 25분 동안 둡니다. 파이펫의 1 mL 블루 팁을 사용하여 엽(lobes)을 10초 동안 부드럽게 트리튜레이션(triturate)한 다음 다시 인큐베이터에 넣습니다. 20분 후, 엽을 완전히 분산시키기 위해 파이펫으로 위아래로 섞어줍니다.단일 세포 현탁액을 만들기 위해, 트립신을 중화시키도록 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 10% FCS 첨가물 400 µL를 넣습니다. 4 °C에서 1,000 RPM으로 10분간 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고, 필요한 경우 1 mL의 RPMI 1640 10% FCS 첨가물에 펠릿을 재현탁합니다. 세포 수를 측정합니다.일반적으로 E 15 섬유아세포로부터 시작하여 디오신 로브(dioxazine lobe)당 약 50,000개의 세포가 생성될 것으로 예상합니다. 이제 1.5 mL 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에서 응집 fmic Corgan 배양물을 형성할 준비가 되었습니다. 신선하게 준비된 섬유아세포를 혼합하십시오.미리 선택된 CD4 양성 CD8 양성 섬유세포와 함께 사용합니다. 기질 세포와 섬유세포의 비율은 약 1:1로 권장합니다. 사용할 세포 수는 가용한 세포의 양과 수행할 실험에 따라 달라집니다.총 세포 수는 최소 10만 개에서 최대 150만 개 이하로 권장합니다. V 응집체가 재현 가능할 정도로 충분히 커야 하지만, 중심부의 세포가 사멸할 정도로 너무 커서는 안 됩니다. 1,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성하십시오. 4°C에서 장기 배양 필터를 조심스럽게 조립하십시오.P 200 피펫을 사용하여 상층액을 모두 제거합니다. 세포 펠렛을 10초 동안 볼텍싱하여 슬러리 상태로 만듭니다. 부피는 약 1~2 µL가 되어야 합니다.세포 현탁액이 피펫 팁 끝에 유지되도록 슬러리를 가늘게 빨아들입니다. 해부 현미경 하에서 세포 슬러리를 0.8 µm 필터 중앙에 조심스럽게 분주합니다. 이상적으로는 세포가 직경 1~2 mm의 원형 내에 정지 방울(standing drop) 형태로 배치되어야 합니다.슬러리가 퍼지기 시작하면, 남은 세포를 배치하기 전에 슬러리 내의 액체가 포어(pore)를 통해 배수되도록 하십시오. 디쉬를 플라스틱 샌드위치 박스에 넣고 밀봉합니다. 흉선 기관 배양과 마찬가지로 박스를 인큐베이터에 넣으면, 응집 배양물은 배양 후 18시간 이내에 온전한 구조체로 형성됩니다.4~5일간 배양하면 CD4 양성 CD8 음성 및 CD4 음성 CD8 양성 성숙 T 세포 서브셋이 모두 생성됩니다. 50개의 dioxazine 처리된 엽(lobe)으로 시작하면 3~5개의 재응집 배양물을 준비할 수 있는 충분한 기질 세포를 얻을 수 있습니다. 이러한 배양물은 일반적으로 응집된 세포 덩어리 형태로 나타나며, 핀셋을 사용하여 파손 없이 필터에서 밀어내어 분리할 수 있습니다.우리는 방금 F 상피세포에 의한 양성 선택을 연구하는 방법을 설명했습니다. 이 방법은 수지상 세포 매개 음성 선택을 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 마지막으로, TCR 형질전환 FIBROCYTES 또는 MHC Class one 결핍 또는 MHC Class two 결핍 기질 세포를 사용하여 연구할 수 있습니다.이 시스템을 통해 CD4 양성 또는 CD8 양성 T세포 선택에 대한 개별적인 연구가 가능합니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 절개와 태아 thymus의 제거뿐만 아니라 2 dGuo - 처리 thymus의 전 생체내 문화의 준비를 보여줍니다.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

이 동영상은 3차원 흉선 배양 시스템을 사용하여 iPSC 유래 미성숙 T 세포에서 기능적 항원 특이적 T 세포를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다. iPSC 유래 미성숙 T 세포를 내인성 림프구가 고갈된 마우스 태아 흉선엽과 함께 배양한 결과, T 세포가 성공적으로 성숙하여 CD8αβ+ MHC 클래스 I+ iPSC 유래 흉선 이민자(iTE)를 형성했습니다.

iPSC 유래 흉선 이민자를 생성하기 위한 3차원 흉선 배양 시스템

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

현재의 2D 배양 시스템이 in vivo 시나리오를 모방하지 않기 때문에 in vitro에서 수질 흉선 상피 세포를 연구하는 것은 대체로 성공적이지 못했습니다. 본 명세서에 기술된 3D 배양 시스템(변형된 피부 유기형 배양 모델)은 mTEC 증식, 분화 및 난잡한 유전자 발현의 유지를 재현하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

이 기사는 T 세포 자손의 생성, 표현형 및 수의 동역학을 분석하여 흉선 침전 전구 세포를 특성화하는 생체 내 및 시험관 내 방법론에 대해 설명합니다.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

이 비디오는 FACS 분리를 위해 밀도 구배로 흉선 상피 세포(TECH)를 강화하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한 EAK16-II/EAKIIH6 펩타이드를 사용하여 TEC 응집체 형성을 촉진하는 것을 보여줍니다. EAK16-II/EAKIIH6 하이드로겔의 미세환경은 TEC의 생존과 기능을 유지하는 데 필요한 3D 구성을 제공합니다.

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

우리는 유동 세포 계측법와 함께, T 세포 현상의 양 및 음의 선택을 모델링하는데 사용될 수 있고, 흉선 조각의 제조를 설명한다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 마이그레이션, 현지화의 현장에서 분석하도록하고, 면역 및 두 광자 현미경을 통해 시그널링 할 수있다.

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

여기에서는 흉선 상피 세포(TEC) 성숙 및 장기간의 유지 관리, 체외 흉선형성을 지원하는 것을 목표로 하는 3D 피브린 하이드로겔에서 성장한 인간 iPSC 유래 흉선 오가노이드 형성을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

학습하세요 2-dGuo 처리된 재응집 흉선 배양법으로 T세포 분화와 세포 간 상호작용을 연구하는 방법을. CD4 및 CD8 양성 T세포 하위집합 생성과 양성 및 음성 선택 연구에 활용할 수 있습니다.

Thymus 문화 Reaggregate

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