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안녕하세요, 저는 버밍엄 대학교 MRC 면역 조절 센터의 Graham Anderson 및 Eric Jenkinson 교수님 연구실 소속 Andrea White입니다. 오늘은 T 세포 분화 과정 중에 발생하는 복잡한 세포 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 재응집 흉선 기관 배양법을 소개하겠습니다. 본 절차를 시작하기 전에, 배아 흉선 엽을 분리하고 모든 림프구를 제거하는 처리를 거쳤습니다.

이는 별도의 영상에서 확인하실 수 있습니다. 그 후, 외계양 엽(alienoid lobes)을 분산시켜 기질 세포 준비물을 제조합니다. 마지막으로, 세포들을 다시 응집시켜 재응집 fmic 장기 배양물을 형성합니다.

시작하겠습니다. 5~7일간 배양한 후, LO를 분리하여 shoal cell을 준비할 준비가 되면 0.8 µm 필터를 10% FCS가 첨가된 RPMI 1640이 담긴 페트리 접시에 담그십시오. 핀셋을 사용하여 떠오르지 않는 섬유 덩어리를 조심스럽게 밀어내십시오. 1 mL 피펫을 사용하여 로브를 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮기십시오.

각 원심 분리관(centrifuge tube)당 50개 이하의 엽(lobe)을 넣는 것을 권장합니다. 중력 상태에서 엽이 튜브 바닥으로 가라앉도록 둔 다음 배지를 제거하십시오. 1 mL의 PBS로 엽을 세척한 후, 다시 바닥으로 가라앉을 때까지 기다리십시오.

이 과정을 총 3회의 PBS 세척으로 반복하고, 마지막 PBS 세척액을 제거한 후 0.25% trypsin 용액 600 µL를 첨가합니다. 마이크로 튜브를 37 °C 인큐베이터에 25분 동안 둡니다. 파이펫의 1 mL 블루 팁을 사용하여 엽(lobes)을 10초 동안 부드럽게 트리튜레이션(triturate)한 다음 다시 인큐베이터에 넣습니다. 20분 후, 엽을 완전히 분산시키기 위해 파이펫으로 위아래로 섞어줍니다.

단일 세포 현탁액을 만들기 위해, 트립신을 중화시키도록 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 10% FCS 첨가물 400 µL를 넣습니다. 4 °C에서 1,000 RPM으로 10분간 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고, 필요한 경우 1 mL의 RPMI 1640 10% FCS 첨가물에 펠릿을 재현탁합니다. 세포 수를 측정합니다.

일반적으로 E 15 섬유아세포로부터 시작하여 디오신 로브(dioxazine lobe)당 약 50,000개의 세포가 생성될 것으로 예상합니다. 이제 1.5 mL 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에서 응집 fmic Corgan 배양물을 형성할 준비가 되었습니다. 신선하게 준비된 섬유아세포를 혼합하십시오.

미리 선택된 CD4 양성 CD8 양성 섬유세포와 함께 사용합니다. 기질 세포와 섬유세포의 비율은 약 1:1로 권장합니다. 사용할 세포 수는 가용한 세포의 양과 수행할 실험에 따라 달라집니다.

총 세포 수는 최소 10만 개에서 최대 150만 개 이하로 권장합니다. V 응집체가 재현 가능할 정도로 충분히 커야 하지만, 중심부의 세포가 사멸할 정도로 너무 커서는 안 됩니다. 1,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성하십시오. 4°C에서 장기 배양 필터를 조심스럽게 조립하십시오.

P 200 피펫을 사용하여 상층액을 모두 제거합니다. 세포 펠렛을 10초 동안 볼텍싱하여 슬러리 상태로 만듭니다. 부피는 약 1~2 µL가 되어야 합니다.

세포 현탁액이 피펫 팁 끝에 유지되도록 슬러리를 가늘게 빨아들입니다. 해부 현미경 하에서 세포 슬러리를 0.8 µm 필터 중앙에 조심스럽게 분주합니다. 이상적으로는 세포가 직경 1~2 mm의 원형 내에 정지 방울(standing drop) 형태로 배치되어야 합니다.

슬러리가 퍼지기 시작하면, 남은 세포를 배치하기 전에 슬러리 내의 액체가 포어(pore)를 통해 배수되도록 하십시오. 디쉬를 플라스틱 샌드위치 박스에 넣고 밀봉합니다. 흉선 기관 배양과 마찬가지로 박스를 인큐베이터에 넣으면, 응집 배양물은 배양 후 18시간 이내에 온전한 구조체로 형성됩니다.

4~5일간 배양하면 CD4 양성 CD8 음성 및 CD4 음성 CD8 양성 성숙 T 세포 서브셋이 모두 생성됩니다. 50개의 dioxazine 처리된 엽(lobe)으로 시작하면 3~5개의 재응집 배양물을 준비할 수 있는 충분한 기질 세포를 얻을 수 있습니다. 이러한 배양물은 일반적으로 응집된 세포 덩어리 형태로 나타나며, 핀셋을 사용하여 파손 없이 필터에서 밀어내어 분리할 수 있습니다.

우리는 방금 F 상피세포에 의한 양성 선택을 연구하는 방법을 설명했습니다. 이 방법은 수지상 세포 매개 음성 선택을 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 마지막으로, TCR 형질전환 FIBROCYTES 또는 MHC Class one 결핍 또는 MHC Class two 결핍 기질 세포를 사용하여 연구할 수 있습니다.

이 시스템을 통해 CD4 양성 또는 CD8 양성 T세포 선택에 대한 개별적인 연구가 가능합니다. 시청해 주셔서 감사합니다.