August 28th, 2008
이 비디오에의 준비 2 dGuo - 처리 증명 thymus 문화를 reaggregate.
안녕하세요, 저는 버밍엄 대학의 MRC 면역 조절 센터의 그레이엄 앤더슨(Graham Anderson)과 에릭 젠킨슨(Eric Jenkinson)의 연구실에서 온 안드레아 화이트(Andrea White)입니다. 오늘 저는 T 세포 분화 중에 발생하는 복잡한 세포 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 재응집 흉선 장기 배양을 유도하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차를 시작하기 전에 배아 흉선엽을 분리하고 모든 림프구를 제거하기 위해 처리했습니다.
이것은 별도의 비디오에서 볼 수 있습니다. 그런 다음 외계형 엽을 분해하여 기질 세포 제제를 생성합니다. 마지막으로, 세포를 응집하여 재응집된 fmic 장기 배양을 형성합니다.
의 시작하자. 배양에서 5-7일 후, LO는 얕은 세포 준비를 위해 분해할 준비가 되어야 합니다.RPMI 1640과 10%FCS가 포함된 페트리 접시에 0.8마이크로미터 필터를 담그고 집게를 사용하여 떠오르지 않는 섬유 경사면을 부드럽게 밀어냅니다. 애완 동물당 1mil을 사용하여 엽을 1.5mil eend orph tube로 이동합니다.
엔드 고아관당 50개 이하의 엽을 권장합니다. 로브가 단위 중력 하에서 튜브 바닥에 정착하도록 하고 매체를 제거합니다. 1mil PBS로 엽을 씻은 다음 엽을 다시 바닥으로 가라앉힙니다.
총 3번의 PBS 세척에 대해 이 작업을 반복하고 마지막 PBS 세척을 제거하고 용액에 600마이크로리터의 0.25%트립을 추가합니다. einor 튜브를 37도 인큐베이터에 25분 동안 놓습니다. 퍼펫에 1mil blue 팁을 사용하여 10초 동안 엽을 부드럽게 삼중화한 다음 20분 후에 다시 인큐베이터에 넣고 엽을 위아래로 피펫으로 하여 완전히 분해합니다.
그것은 약 30 초가 소요되어야한다단일 세포 현탁액을 달성하려면, 400 마이크로 리터의 얼음을 차갑게, RPMI 1640 플러스 10 % FCS를 추가하여 트립신 임프 펠렛을 중화하고, 1,000 RPM에서 원심 분리, 4 °C에서 10 분, sup natant를 제거하고 펠릿을 1mil에 다시 현탁시킵니다. RPMI 1640 플러스 10%FCS 원하는 경우. 셀 수를 셉니다.
전형적으로 우리는 다이옥사진 엽 당 약 50, 000개의 세포를 예상할 것입니다, E 15 섬유질에서 시작해서. 이제 우리는 1.5 mil eend orph tube에서 집합체 fmic Corgan cultures를 형성 할 준비가되었습니다. 갓 준비한 혼합 미세 기질 세포.
사전 선택된 CD 4개, 양성 CD 8개, 양성 섬유세포와 함께. 기질 세포와 섬유세포의 비율이 약 1:1 정도가 되는 것이 좋습니다. 사용할 세포의 수는 사용 가능한 세포의 수와 수행할 실험에 따라 다릅니다.
총 10만 개 이상의 세포에서 150만 개 이하의 세포를 권장합니다. V 응집체가 재현 가능할 만큼 충분히 크지만 센터가 10분 동안 1,000RPM에서 원심분리하여 펠릿 세포를 죽일 정도로 크지 않아야 합니다. 섭씨 4도에서 장기 배양 필터를 조심스럽게 조립합니다.
애완동물 한 마리당 P 200으로 SUP 나틴을 모두 제거하십시오. 와류 세포 펠릿을 10초 동안 사용하여 슬러리를 형성합니다. 부피는 약 1-2 마이크로 리터 입이어야합니다.
슬러리를 곱게 뽑은 애완 동물에 쓰다듬어 애완 동물 끝에 세포의 현탁액을 유지합니다. 해부 현미경으로 세포 슬러리를 0.8 마이크로미터 필터의 중앙에 조심스럽게 입으로 PET합니다. 이상적으로, 세포는 직경이 1-2mm인 원 안에 서 있는 방울로 배치되어야 합니다.
슬러리가 퍼지기 시작하면 나머지 세포를 침전하기 전에 슬러리의 유체가 pos를 통해 배출되도록하십시오. 접시를 플라스틱 샌드위치 상자에 넣고 밀봉합니다. 흉선 장기 배양에 관해서는, 인큐베이터에 상자를 넣으면 배양 후 18시간 이내에 배양 형태를 온전한 구조로 응집합니다.
4-5일의 배양 후, 그들은 CD 4개의 양성 8개 음성 및 CD 4개의 음성 8개의 양성 성숙 세포 부분 집합을 모두 생성합니다. 50개의 다이옥진으로 처리된 엽은 3-5개의 재응집 배양을 준비하기에 충분한 기질 세포를 제공해야 합니다. 이러한 배양물은 일반적으로 집게를 사용하여 필터를 방해하지 않고 밀어낼 수 있는 세포의 일관된 덩어리로 나타납니다.
우리는 방금 F 상피 세포에 의한 양성 선택을 연구하는 방법을 설명했습니다. 이 방법은 수지상 세포 매개 음성 선택을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 마지막으로, TCR 형질전환 섬유세포 또는 MHC 클래스 1 결핍 또는 MHC 클래스 2 결핍 기질 세포를 사용합니다.
이 시스템을 사용하면 CD 4 양성 또는 CD 8 양성 T 세포 선택에 대한 별도의 조사가 가능합니다. 시청해 주셔서 감사합니다.
이 동영상은 2-dGuo로 처리한 재집합 흉선 배양의 준비를 시연합니다. 이러한 배양은 T-세포 분화 및 세포 상호작용 연구에 필수적입니다.
Reaggregate thymus cultures enable precise dissection of stromal-hematopoietic interactions critical for T-cell lineage commitment and selection. This three-dimensional in vitro system supports mechanistic de-risking at the target validation stage by allowing controlled manipulation of cellular composition and microenvironment. The approach enhances predictive confidence for immunology-focused discovery portfolios by modeling key aspects of thymic selection and self/non-self discrimination.
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling controlled, quantitative studies of thymic selection mechanisms in a physiologically relevant context.