Name: 2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 배우세요 태아 흉선 오르간 배양 기법으로 2-dGuo 처리를 통해 림프구를 선택적으로 제거하고 T세포 발달을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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방문하십시오 <a href="http://www.springerprotocols.com/">스프링거 프로토콜</a> 예 생체내 thymus 기관 문화의 준비에 대한 자세한 내용은합니다.

저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

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Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

2 dguo - 치료 thymus 오르간 문화의 준비

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

thymus, 미숙 CD4 8 + 무작위로 재배열 T - 세포 수용체를 표현 thymocytes에서 α - 및 B - 체인 유전자 self-peptide/major의 histocompatibility 복합 (MHC) thymic로 표현 분자를 인식하는 능력에 따라 긍정적이고 부정적인 선택 이벤트를 받다 stromal 세포. intrathymic 선택하는 동안 thymic stromal 세포의 역할의 생체내 분석에 정상 상태 성인 thymus에서 thymic microenvironment의 세포 복잡하여 어렵게 만든, 적절한 타겟팅 전략의 부족에 의해 특정 thymic stromal 구획의 유전자 발현을 조작할 수 있습니다. 우리는 thymic microenvironment가 쉽게 정의 stromal과 림프 세포의 입체 thymus 엽 (叶)의 준비를 허용 thymus 장기 문화를 reaggregate의 사용을 통해 체외로 조작할 수있는 것으로 나타났습니다. 체외 시스템의 다른 T 세포 개발의 일부 측면을 지원하지만, thymus 장기 문화 I 및 II - 중재 thymocyte 선택 이벤트, 그래서이 연구는 효과적인 도구로 사용할 수있는 유일한 체외 시스템의 효율적인 MHC 클래스를 지원할 수 남아 reaggregate thymus에서 긍정적이고 부정적인 선택의 세포 및 분자 규제.

이 동영상은 절개와 태아 thymus의 제거뿐만 아니라 2 dGuo - 처리 thymus의 전 생체내 문화의 준비를 보여줍니다.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

흉선에서, 발달 중인 T세포 전구세포와 피질 및 수질 상피세포를 포함하는 기질 세포 간의 상호작용은 ...을 하는 것으로 알려져 있습니다.

안녕하세요, 버밍엄 대학교 MRC 면역 조절 센터의 Graham Anderson 및 Eric Jenkinson 연구팀 소속 Will Jenkinson입니다. 오늘은 태아 흉선 기관 배양물을 설정하는 기술을 보여드리겠습니다. 또한, 이러한 기관 배양물에 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)을 처리하는 방법도 함께 안내해 드리겠습니다.그리고 이것은 기관 배양 내의 림프구 세포에 선택적으로 독성을 나타내는 물질입니다. 실험실에서 이 기술의 몇 가지 응용 분야가 있는데, 그 중 하나가 재응집 기관 배양의 제작입니다.다른 응용 분야로는 세포 발달의 다양한 단계를 연구하는 것이 있으며, 태아 흉선 기관 배양을 통해 서로 다른 경로를 억제하거나 자극하는 시약을 첨가함으로써 이 과정에서 특정 분자의 역할을 연구할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 흉선 기관 배양을 준비하는 첫 번째 단계는 1~2마리의 임신한 어미 쥐로부터 배아 14일 또는 15일 차의 마우스 배아를 수확하는 것입니다.먼저, 안락사시킨 마우스에 70% ethanol을 분사합니다. 그런 다음 핀셋으로 털을 당긴 후, 가위로 방광에서 시작하여 자궁의 양측각을 따라 위쪽으로 V자형 절개를 복부 영역에 실시합니다. 자궁각을 제거하여 멸균된 10 centimeter 페트리 접시에 넣습니다.자궁벽을 따라 길게 절개하고 양막에 싸인 배아를 제거합니다. 두 쌍의 미세 핀셋을 사용하여 10 mL PBS가 담긴 페트리 접시에서 배아를 세척합니다. 양막을 조심스럽게 찢어 배아를 양막과 태반으로부터 분리합니다.다음으로, PBS와 10% FCS가 포함된 RPMI 1640 배지를 50:50으로 혼합하여 10 mL 담은 새 페트리 접시에 배아를 옮깁니다. 해부 현미경 하에서 배아가 배지에 잠긴 상태로 핀셋을 사용하여 배아의 머리를 제거합니다. 닫힌 핀셋의 끝을 흉강에 넣은 후 핀셋을 벌려 흉벽의 전면을 절개하여 내부 흉강을 노출시킵니다.심장 아래쪽을 조심스럽게 잡아 흉식도, 심장, 폐, 기관 및 흉선을 완전히 제거한 후, RPMI 1640 및 10% FCS 5 mL가 담긴 35 mm 디시에 넣습니다. 배아 14~15일령에서 초기 흉선엽은 기관 양측, 심장 바로 윗부분에 위치합니다.미세 핀셋을 사용하여 개별 흉선 엽을 제거하고, 장기 배양으로 확장하기 전에 과잉 결합 조직과 부착된 혈액을 모두 제거합니다. 이제 장기 배양 준비가 완료되었습니다. 림프구 해독제를 만들기 위해 9 mM의 2-deoxyadenosine 스톡 용액을 가져와 90 mm 박테리아용 플라스틱 페트리 접시에 600 µL를 분주하여 준비합니다.미리 데워둔 DMEM 배지 4 mL를 추가하고, 배지가 표면 전체를 덮도록 디쉬를 부드럽게 흔들어 섞습니다. T 세포 발달 연구를 위한 림프구 배양을 원하는 경우, 포셉을 사용하여 두 개의 dioxazine을 제외합니다. 1 cm² 크기로 미리 절단된 멸균 아트 랩 스펀지 두 개를 디쉬 안에 넣습니다.배지가 스펀지에 약 30초 동안 흡수되도록 둡니다. 그런 다음 스펀지를 뒤집어 양면을 모두 적십니다. 다시 한번 포셉을 사용하여 디쉬 안의 배지가 조직에 닿을 수 있도록 합니다.각 스펀지 표면에 멸균된 0.8 micron 필터를 배치합니다. 흉선 조각을 장기 배양 필터로 옮기기 위해, 필터의 광택 나는 면이 위로 향하도록 스펀지 지지대 위에 놓습니다. 유리 피펫을 제작하기 위해 match control 유리 피펫을 사용합니다. 분젠 버너 불꽃 위에서 유리관을 가열하고, 유리가 말랑말랑해지면 불꽃에서 제거한 후 양끝을 잡아당겨 유리를 10 centimeters 이하로 늘린 다음 식힙니다.그런 다음 양 끝을 잡아당겨 유리를 부러뜨립니다. 이렇게 하면 두 개의 원추형 유리 파이펫이 만들어집니다. 각 파이펫의 얇은 부분은 길이가 약 5 cm이며, 끝부분의 직경은 약 0.5 mm입니다.피펫 장치를 설정하려면, 플라스틱 피펫 팁을 반대쪽 끝에 마우스피스로 끼우고 유리 피펫의 뭉툭한 끝부분을 튜빙에 넣습니다. 마우스 피펫을 사용하여 개별 흉선 엽을 조심스럽게 집어 0.8 micron 필터 표면에 올립니다. 기관 배양 시, 필터당 5~6개의 흉선 엽을 올려 디시당 총 10~12개의 흉선 엽을 배치하는 것을 권장합니다.이를 통해 장기 배양물이 성장할 수 있는 충분한 공간을 확보하고, 두 종류의 dioxazine이 모든 내인성 림프구 세포를 제거할 수 있게 합니다. 배양 설정이 완료되면, 10cm 페트리 접시 뚜껑을 플랫폼으로 사용하고 플랫폼 높이 바로 아래까지 2차 증류수를 채워 샌드위치 박스 뚜껑을 조립합니다. 최대 3개의 접시를 박스에 넣고 테이프로 뚜껑을 밀봉합니다.뚜껑의 서로 반대되는 모서리에 5 mm 크기의 공기 구멍 두 개를 뚫어야 합니다. 박스들을 37 °C, 10% CO2 조건의 배양기에 5~7일 동안 보관하며, 이후 이 배양물들을 해체했다가 다시 응집시켜 제어된 3차원 환경에서 기질 흉선 부위 간의 상호작용을 연구합니다. 통상적으로 5~7일의 배양 기간이 지난 후, 필터를 배지에 담그고 엽을 조심스럽게 밀어내어 F-talk를 수확합니다. 핀셋을 사용하여 확인하면, 림프구 F-talk는 일반적으로 비-dioxazine 처리된 림프구 엽에 비해 더 작고 낭성인 것을 볼 수 있습니다.지금까지 태아 흉선 기관 배양을 설정하는 기술을 보여드렸습니다. 본 프로토콜에서는 태아 흉선 기관 배양물을 2-deoxycytidine으로 처리하는 방법을 설명했으며, 이를 통해 일반적으로 흉선을 5~7일간 배양한 후 모든 림프구 세포를 제거할 수 있습니다. 이러한 기관 배양물은 재응집 기관 배양물을 제작하는 데 사용됩니다.하지만 이것이 유일한 기술은 아닙니다. 우리는 또한 dioxazine 처리를 하지 않은 태아 흉선 기관 배양물을 흉선 마우스의 신장 캡슐 하단으로 이식하는 방법도 사용합니다. 아울러, 체내에서 발생할 수 있는 2차적 영향 없이 통제된 인비트로(in vitro) 조건에서 T-세포 발달을 연구하기 위해 림프구 태아 흉선 기관 배양물을 사용합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

preparation-of-2-dguo-treated-thymus-organ-cultures

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에의 준비 2 dGuo - 처리 증명 thymus 문화를 reaggregate.

Thymus 문화 Reaggregate

본 연구진은 흉선의 생체 내 영상 획득을 위한 새로운 실험실 도구 및 프로토콜을 개발하였습니다. 이러한 기술은 T 세포 발달이 일어나는 흉선 내의 "니치(niches)"를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

이 동영상은 3차원 흉선 배양 시스템을 사용하여 iPSC 유래 미성숙 T 세포에서 기능적 항원 특이적 T 세포를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다. iPSC 유래 미성숙 T 세포를 내인성 림프구가 고갈된 마우스 태아 흉선엽과 함께 배양한 결과, T 세포가 성공적으로 성숙하여 CD8αβ+ MHC 클래스 I+ iPSC 유래 흉선 이민자(iTE)를 형성했습니다.

iPSC 유래 흉선 이민자를 생성하기 위한 3차원 흉선 배양 시스템

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

현재의 2D 배양 시스템이 in vivo 시나리오를 모방하지 않기 때문에 in vitro에서 수질 흉선 상피 세포를 연구하는 것은 대체로 성공적이지 못했습니다. 본 명세서에 기술된 3D 배양 시스템(변형된 피부 유기형 배양 모델)은 mTEC 증식, 분화 및 난잡한 유전자 발현의 유지를 재현하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

우리는 유동 세포 계측법와 함께, T 세포 현상의 양 및 음의 선택을 모델링하는데 사용될 수 있고, 흉선 조각의 제조를 설명한다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 마이그레이션, 현지화의 현장에서 분석하도록하고, 면역 및 두 광자 현미경을 통해 시그널링 할 수있다.

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

우리는 2'-데옥시구아노신 처리 된 E18.5 흉선을 누드 마우스의 신장 캡슐로 이식하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이 방법은 흉선 상피 세포 기능과 T 세포 성숙 의 연구에서 보좌관해야한다.

누드 마우스에서 2'-Deoxyguanosine 처리 된 뮤린 배아 흉골의 신장 탈모 이식

여기에서는 흉선 상피 세포(TEC) 성숙 및 장기간의 유지 관리, 체외 흉선형성을 지원하는 것을 목표로 하는 3D 피브린 하이드로겔에서 성장한 인간 iPSC 유래 흉선 오가노이드 형성을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

배우세요 태아 흉선 오르간 배양 기법으로 2-dGuo 처리를 통해 림프구를 선택적으로 제거하고 T세포 발달을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

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